mplisia merupakan hal yang sangat
penting. Label yang melekat pada kemasan harus menunjukkan
informasi simplisia dengan jelas, meliputi: nama ilmiah tanaman
obat. asal bahan, tanggal panen dan tanggal simpan, berat simplisia,
dan status kualitas bahan
8. Penyimpanan
Simplisia yang sudah dikemas dan diberi label, kemudian dapat
disimpan di dalam gudang yang telah disiapkan. Tujuan dilakukan
proses penyimpanan yaitu agar simplisia yang sudah dibuat dapat
mempertahankan kualitasnya, baik kualitas fisik maupun kestabilan
kandungan senyawa aktif, sehingga tetap memenuhi persyaratan
mutu yang telah ditetapkan.
Hal-hal yang perlu diperhatikan mengenai tempat penyimpan
simplisia yaitu :
a. Gudang harus terpisah dari tempat penyimpanan bahan lainnya
ataupun penyimpanan alat dan dipelihara dengan baik
b. Ventilasi udara cukup baik dan bebas dari kebocoran atau
kemungkinan masuknya air hujan
c. Suhu gudang tidak melebihi 30oC
d. Kelembaban udara sebaiknya diusahakan serendah mungkin
(sekitar 65%) unutk mencegah terjadinya penyerapan air
e. Kelembaban udara yang tinggi dapat memacu pertumbuhan
mikroorganisme sehingga menurunkan mutu simplisia, baik
dalam bentuk segar ataupun kering.
f. Sinar matahari tidak boleh langsung mengenai simplisia
g. Mencegah masuknya hewan baik serangga maupun tikus atau
hewan pengerat lainnya yang dapat memakan simplisia
Selama dalam masa penyimpanan, simplisia dapat mengalami
kerusakan dan penurunan kualitas disebab kan beberapa faktor, yaitu:
a. Cahaya
Cahaya sinar dengan panjang gelombang tertentu dapat
memengaruhi mutu simplisia secara fisik dan kimiawi, misalnya
adanya proses isomerase dan polimerasi.
b. Reaksi kimia internal
Proses fermentasi, reaksi polimerisasi, atau reaksi autooksidasi
dapat memicu perubahan kimia simplisia
c. Oksidasi
Oksigen dari udara atau yang ada di sekitar simplisia dapat
memicu teroksidasinya senyawa aktif simplisia, sehingga
kualitas simplisia dapat menurun
d. Dehidrasi
Bila kondisi kelembaban di luar lebih rendah daripada di dalam
simplisia, maka akan terjadi proses kehilangan air.
e. Absorpsi air
Pada simplisia yang higroskopis dapat menyerap air di
lingkungan sekitarnya. Sehingga simplisia dapat menjadi lembab,
dan dalam masa penyimpanan, simplisia dapat mengalami
kerusakan
f. Kontaminasi
Sumber kontaminan utama yaitu debu, pasir, kotoran bahan asing
g. Serangga
Serangga dapat menimbulkan kerusakan dan pengotoran
simplisia, misalnya dalam bentuk larva, imago, dan sisa-sisa
metamorfosisnya (kulit telur, kerangka yang telah using, dan
lain-lain)
h. Kapang
Jika simplisia masih dalam kondisi memiliki kadar air yang
cukup tinggi, maka akan mudah ditumbuhi kapang selama masa
penyimpanan. Jamur, ragi, serta jasad renik lain dapat
menguraikan senyawa aktif atau menghasilkan senyawa beracun
yang membahayakan konsumen (B2P2TOOT, 2011).
Cara penyimpanan simplisia sejenis juga harus mengikuti konsep “first in first
out”, artinya simplisia yang disimpan lebih awal harus dipakai terlebih
dahulu. Dengan melakukan pengelolaan pascapanen pada tanaman obat secara
tepat dan benar, diharapkan simplisia yang disimpan dapat terjaga kestabilan
dan mutunya
3.3 Ekstraksi
Senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam tanaman obat biasanya
dalam jumlah yang sangat sedikit. Seperti yang sudah diketahui, bahwa
senyawa pada tanaman obat yang memiliki aktivitas biologis tertentu yang
dapat membantu mengobati penyakit pada manusia yaitu metabolit sekunder.
Salah satu cara yang dapat dipakai untuk mendapatkan manfaat dari
metabolit sekunder yaitu dengan menarik dan atau mengambil sari atau
memisahkan kandungan metabolit sekunder yang ada dalam tanaman
obat. Cara yang paling umum dipakai yaitu dengan metode ekstraksi.
Metode ekstraksi dapat dipilih berdasar pada sifat metabolit sekunder yang
akan diekstraksi. Sebelum memilih suatu metode, harus menentukan terlebih
dahulu apa yang akan menjadi target ekstraksi.
Ada beberapa yang merupakan target ekstraksi (Mukhtarini, 2014), di
antaranya yaitu :
1. Senyawa bioaktif yang tidak diketahui
2. Senyawa yang diketahui ada pada suatu organisme
3. Sekelompok senyawa dalam suatu organisme yang berhubungan
secara struktural.
Adapun langkah-langkah dari proses ekstraksi di antaranya yaitu pembuatan
serbuk simplisia terlebih dahulu. Tujuan dari pembuatan serbuk yaitu
memperluas permukaan serbuk. Ekstraksi akan semakin baik bila permukaan
serbuk simplisia yang bersentuhan dengan pelarut semakin luas, serta semakin
pendek jarak difusi pelarut sehingga kecepatan esktraksi lebih besar, maka
semakin halus serbuk simplisia maka akan semakin baik hasil ekstraksinya.
namun perlu diperhatikan pada bahan simplisia yang mengandung minyak
atsiri, jika serbuk terlalu kecil maka dinding sel dapat pecah, dan minyak atsiri
akan keluar. Langkah selanjutnya yaitu pembahasan, yang bertujuan untuk
memberi kesempatan pelarut memasuki pori-pori simplisia sehingga
memudahkan penyarian. Selanjutnya yaitu penyarian, pada tahapan ini
system yang bekerja yaitu osmosis dan difusi.
Pada proses penyarian ini, lama waktu ekstraksi juga merupakan faktor yang
berpengaruh pada hasil ekstraksi. Waktu ekstraksi yang terlalu singkat
mengakibatkan tidak semua senyawa larut dalam pelarut yang dipakai , dan
apabila waktu ekstraksinya terlalu lama, maka tidak akan mengakibatkan
peningkatan berat zat aktif yang terekstrak sebab pelarut yang dipakai
sudah terlalu jenuh, sehingga tidak mampu lagi untuk menarik zat aktif pada
tanaman. Langkah terakhir pada proses ekstraksi yaitu pemekatan, yang
bertujuan untuk mengurangi pelarut yang dipakai pada proses penyarian.
Pemekatan ekstrak dapat dilakukan dengan beberapa metode yaitu:
memakai waterbath, diuapkan dengan rotary evaporator, dan
memakai freeze dryer.
Definisi Ekstraksi
Ekstraksi yaitu proses penarikan komponen atau zat aktif dari suatu
campuran padatan dan/atau cairan dengan memakai pelarut tertentu yang
sesuai. Proses ekstraksi merupakan langkah awal yang penting dalam suatu
penelitian tanaman obat, disebab kan proses ini akan menghasilkan produk
ekstrak kasar yang merupakan titik awal untuk isolasi dan pemurnian
komponen kimia yang ada pada tanaman. Ekstraksi dinyatakan selesai
ketika konsentrasi senyawa dalam pelarut dan konsentrasi dalam simplisia
telah terjadi tercapai kesetimbangannya.
Metode Ekstraksi
Metode yang dipakai untuk melakukan ekstraksi, masing-masing memiliki
kelebihan dan kekurangan. Pemilihan metode dilakukan dengan
memperhatikan sifat senyawa, alat yang tersedia, dan pelarut yang dipakai .
Selain itu saat akan melakukan proses ekstraksi, ada beberapa hal yang harus
menjadi pertimbangan, di antaranya yaitu zat yang akan diekstraksi, pelarut
yang dipakai dan metode yang akan dipakai. Metode ekstraksi yang
dipakai tergantung pada sifat fisika dan kimia zat aktif yang akan
diekstraksi. Penarikan zat aktif ini didasarkan pada prinsip distribusi
komponen zat aktif ke dalam suatu pelarut yang dikenal dengan istilah like
dissolve like yang artinya senyawa yang polar akan larut dalam pelarut polar
dan senyawa non polar akan larut dalam pelarut non polar, maka zat aktif atau
senyawa target yang diinginkan dapat dipisahkan dari campurannya secara
selektif dalam pelarut yang dipakai . Pemilihan pelarut harus
mempertimbangkan banyak faktor, dintaranya harus mempu melarutkan zat
aktif, stabil secara fisika dan kimia, bersifat inert, dan tidak memengaruhi zat
aktif.
Hal yang menjadi pertimbangan selanjutnya pada proses ekstraksi yaitu di
dalam tanaman obat biasanya mengandung berbagai macam senyawa kimia,
maka diperlukan metode ekstraksi yang mutakhir, yang dapat menyari
senyawa dalam jumlah kecil. Secara umum metode ekstraksi dibedakan
berdasar ada atau tidaknya proses pemanasan. Pemanasan ini sangat
berpengaruh terhadap efektivitas proses ekstraksi dan tergantung juga pada
senyawa target yang akan diekstraksi. Ekstraksi dingin pada prinsipnya tidak
membutuhkan pemanasan selama proses ekstraksi, cocok dipakai untuk
senyawa aktif yang tidak tahan terhadap pemanasan yang bertujuan untuk
menghindari kerusakan senyawa. Sedangkan pada ekstraksi panas
membutuhkan pemanasan pada proses ekstraksi agar mengoptimalkan
senyawa target untuk dapat terlarut dalam pelarut yang dipakai sehingga
proses ekstraksi dapat berjalan dengan cepat. Tentunya suhu dan tekanan yang
dipakai saat proses ekstraksi yaitu hal-hal yang perlu menjadi perhatian
juga. Beberapa metode yang umum dipakai yaitu ekstraksi dingin
(maserasi dan perkolasi), ekstraksi panas (digesti, dekokta, infundasi, sokletasi,
refluks, destilasi), lawan arah (countercurrent, ultrasonic, microwave assisted
extraction), dan ekstraksi gas superkritis (supercritical gas extraction)
Maserasi
Maserasi merupakan salah satu metode ekstraksi yang paling sering dipakai
yaitu dengan cara memasukkan serbuk simplisia dan pelarut yang sesuai ke
dalam suatu wadah inert yang ditutup rapat pada suhu ruang sekitar 20-30oC
agar mencegah penguapan pelarut selama waktu ekstraksi. Prinsip metode
maserasi yaitu perendaman, di mana cairan penyari akan menembus dinding
sel simplisia dan masuk ke dalam rongga sel yang banyak mengandung zat
aktif, kemudian zat aktif akan melarut sebab adanya perbedaan konsentrasi
antara larutan zat aktif di dalam sel dan di luar sel, memicu larutan
terpekat didesak keluar. Peristiwa ini akan terjadi secara berulang, sehingga
terjadilah kesetimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel
Metode maserasi biasanya dilakukan selama beberapa hari, yaitu berkisar 2-14
hari, maka perlu diperhatikan bahwa semakin lama proses perendaman
memicu pelarut mudah terjadi kejenuhan sehingga pelarut tidak mampu
lagi untuk menarik metabolit sekunder yang masih tertinggal pada simplisia.
Metode maserasi dapat dioptimalkan dengan pengadukan, remaserasi, dan
pemanasan. Pengadukan yang dilakukan secara berkala dapat membantu
menghomogenkan senyawa kontak dengan pelarut dan membantu kelarutan
zat aktif ke dalam pelarut sehingga dapat mengoptimalkan hasil ekstraksi.
Sedangkan remaserasi merupakan salah satu metode modifikasi dari maserasi.
Remaserasi merupakan metode ekstraksi yang terjadi pengulangan
penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat yang pertama, dan
seterusnya. Pelarut kedua ditambahkan sebanyak penambahan pelarut pertama.
Penambahan pelarut baru pada proses remaserasi dapat membantu melarutkan
metabolit sekunder yang masih tertinggal pada simplisia. Ekstraksi dihentikan
ketika tidak ada perubahan warna pada pelarut. Kondisi ini menunjukkan
bahwa metabolit sekunder pada simplisia sudah terekstrak secara keseluruhan
(Widiyantoro dan Harlia, 2020).
Keuntungan metode maserasi yaitu dapat juga menghindari risiko rusaknya
senyawa-senyawa dalam tanaman yang bersifat termolabil. Selain beberapa
keuntungan yang dipunyai pada metode maserasi, ada pula kerugian dari
metode maserasi ini, yaitu membutuhkan proses yang lama, pelarut yang
dipakai cukup banyak, dan besar kemungkinan beberapa senyawa dapat
hilang, disebab kan beberapa senyawa mungkin akan sulit diekstraksi pada
suhu kamar
Perkolasi
Perkolasi yaitu proses ekstraksi di mana simplisia yang sudah diserbuk,
diekstraksi dengan pelarut yang cocok dengan cara dilewatkan secara
perlahan-lahan pada suatu kolom atau alat perkolator (wadah silinder yang
dilengkapi dengan kran pada bagian bawahnya) (Hujjatusnaini et al, 2021).
Perkolasi merupakan ekstraksi dengan memakai pelarut yang selalu baru
yang dilakukan pada suhu ruangan. Perkolasi bertujuan supaya zat aktif
tertarik secara keseluruhan dan biasanya dilakukan untuk zat aktif khususmya
yang tidak tahan pemanasan. Prinsip perkolasi yaitu serbuk simplisia
diletakkan pada suatu perkolator, yang bagian bawahnya diberi sekat berpori.
Pelarut dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk simplisia, maka pelarut
akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh
dan dibiarkan menetes perlahan pada bagian bawah. Gerakan ke bawah
disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan yang ada di
atasnya, dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk menahan.
Kekuatan yang berperan pada metode perkolasi antara lain: gaya berat,
kekentalan, daya larut, tegangan permukaan, difusi, osmosis, adesi, daya
kapiler dan daya geseran. Cara ini memerlukan waktu lebih lama, pelarut yang
lebih banyak, dan jika sampel dalam perkolator tidak homogen maka pelarut
akan sulit menjangkau seluruh area. Untuk meyakinkan perlokasi sudah
sempurna, perkolat dapat diuji untuk membuktikan ada atau tidaknya
metabolit sekunder dengan memakai pereaksi yang spesifik
Refluk
Metode refluk merupakan salah satu metode ekstraksi panas dengan
memakai pelarut yang bersifat volatil. Pada kondisi ini jika proses
ekstraksi dilakukan pemanasan biasa, maka pelarut akan menguap sebelum
reaksi berjalan sampai selesai. Prinsip metode ini yaitu sampel dimasukkan
bersama pelarut ke dalam labu yang dihubungkan dengan kondensor. Pelarut
dipanaskan hingga mencapai titik didih. Uap akan masuk ke dalam kondensor,
pelarut yang awalnya berbentuk uap akan mengembun pada kondensor dan
turun lagi ke dalam wadah reaksi atau Labu Alas Bulat (LAB) sehingga
pelarut tetap ada selama reaksi berlangsung. Untuk mengoptimalkan hasil
penyarian, maka refluks umumnya dilakukan berulang-ulang (3-6 kali)
terhadap residu pertama. Cara ini memungkinkan terjadinya penguraian
senyawa yang tidak tahan panas
Sokletasi
Sokletasi merupakan metode atau proses pemisahan zat aktif yang ada
dalam simplisia dengan cara penyaringan berulang-ulang dengan
memakai pelarut tertentu, sehingga zat aktif yang diinginkan akan
terisolasi. Metode ini dilakukan dengan menempatkan serbuk simplisia ke
dalam sarung selulosa (dapat dipakai kertas saring) atau yang disebut
klonsong, kemudian ditempatkan di atas labu dan di bawah kondensor.
Metode ini dilakukan pemanasan, sehingga uap yang timbul setelah masuk ke
dalam kondensor akan turun kembali yang secara kontinyu akan membasahi
sampel, secara teratur pelarut ini dimasukkan kembali ke dalam labu
dengan membawa zat aktif yang akan diisolasi. Keuntungan dari metode ini
yaitu proses ekstraksi dilakukan secara kontinyu, sampel terekstraksi oleh
pelarut hasil kondensasi sehingga tidak membutuhkan banyak pelarut dan
tidak membutuhkan banyak waktu. Di samping itu, metode ini juga memiliki
kerugian yaitu senyawa yang bersifat termolabil dapat terdegradasi sebab
ekstrak yang diperoleh terus-menerus berada pada titik didih
Infundasi
Infundasi yaitu sediaan cair yang dibuat dengan cara mengekstraksi simplisia
nabati dengan pelarut air memakai suhu 90oC selama 15 menit
Ada beberapa hal yang harus diperhatikan apabila akan memakai metode
infundasi, di antaranya yaitu :
1. Adanya penambahan air ekstra, umumnya diperlukan penambahan air
sebanyak 2 kali berat simplisia
2. Penyaringan dilakukan saat panas, kecuali untuk simplisia yang
mengandung minyak atsiri, sebab jika disaring saat panas, maka
minyak atsiri yang terkandung dapat menguap dan berkurang
kadarnya
3. Penyaringan pada simplisia yang mengandung lendir tidak boleh
diperas.
Dekoktasi
Dekoktasi memiliki prinsip yang hamper sama dengan infundasi,
perbedaannya terletak pada lama waktu ekstraksinya. Dekoktasi merupakan
ekstraksi dengan cara perebusan memakai pelarut air, pada temperature
90-95°C selama 30 menit .
3.5.7 Destilasi
Destilasi merupakan suatu proses ekstraksi untuk memisahkan zat aktif dari
suatu campuran dua atau lebih cairan berdasar titik didih dari zat-zat
penyusunannya. Senyawa yang memiliki titik didih lebih rendah akan
menguap terlebih dahulu. Ada beberapa metode destilasi yaitu destilasi air,
uap, dan uap air. Destilasi biasanya dipakai untuk mengekstraksi minyak
esensial (campuran berbagai senyawa yang bersifat volatil). Selama
pemanasan, uap akan terkondensasi dan destilat (terpisah sebagai 2 bagian
yang tidak saling bercampur) ditampung dalam wadah yang terhubung dengan
kondensor. Kerugian dari kedua metode ini yaitu senyawa yang bersifat
termolabil dapat terdegradasi dan rusak, sebab adanya pemanasan dengan
suhu tinggi
Lawan Arah (Counter Current)
Cara ekstraksi ini serupa dengan cara perkolasi pada metode ekstraksi dingin,
namun simplisia bergerak berlawanan arah dengan pelarut yang dipakai .
Cara ini banyak dipakai untuk ekstraksi herbal dalam alat dan skala besar
Ultrasonik
Ekstraksi dengan metode ultrasonik memakai gelombang ultrasonik
dengan frekuensi 20-2000 KHz, sehingga memicu permeabilitas dinding
sel meningkat dan isi sel keluar. Frekuensi getaran dapat memengaruhi hasil
ekstraksi. Faktor ini yang memicu proses ekstraksi dengan memakai
gelombang ultrasonik menjadi lebih cepat dari metode konvensional. Medium
yang dilewati akan mengalami getaran yang disebabkan oleh gelombang
elektronik. Getaran yang diberikan gelombang ultrasonik otomatis akan
memberi pengadukan yang intensif terhadap proses ekstraksi
Gelombang Mikro (Microwave Assisted Extraction,
MAE)
Ekstraksi dengan memakai gelombang mikro (2450 MHz) merupakan
salah satu metode ekstraksi yang selektif dan dipakai untuk senyawa yang
dimiliki dipol polar. Keuntungan pemakaian ekstraksi dengan gelombang
mikro yaitu dapat menghemat waktu ekstraksi dibandingkan dengan cara
konvensional seperti maserasi, serta menghemat pelarut yang dipakai .
Keuntungan yang lainnya yaitu gelombang mikro yang ada di microwave
dapat meningkatkan suhu pelarut pada bahan, sehingga memicu dinding
sel pecah dan zat-zat yang terkandung di dalam sel keluar melarut pada
pelarut, maka rendemen yang dihasilkanpun dapat meningkat
Ekstraksi Gas Superkritis (Supercritical Gas
Extraction, SGE)
Metode ekstraksi ini dilakukan dengan memakai karbondioksida (CO2)
bertekanan tinggi. Metode ini banyak dipakai untuk mengekstraksi minyak
atsiri atau senyawa yang bersifat volatil atau termolabil. pemakaian CO2
lebih disukai sebab bersifat inert dan toksisitasnya yang rendah. Teknologi
superkritis CO2 memakan waktu yang relatif cepat, efisien, dan selektivitas
ekstraksi dapat dikontrol dengan densitas pelarut, biaya rendah, serta
memberi hasil ekstraksi yang lebih baik
Metode Isolasi dan Pemurnian
Metabolit Sekunder
Isolasi metabolit sekunder merupakan tahapan yang dipakai untuk
menemukan bahan alam dari tumbuhan yang memiliki aktivitas farmakologis.
Isolasi merupakan proses pengambilan atau pemisahan senyawa bahan alam
memakai pelarut yang sesuai. Beberapa tahapan yang perlu diperhatikan
dalam isolasi metabolit sekunder yaitu tahapan pemisahan senyawa berupa
ekstraksi, fraksinasi dengan metode tertentu, pemurnian senyawa, dan
identifikasi senyawa. Metode isolasi dan pemurnian senyawa metabolit
sekunder dari tumbuhan yaitu teknik yang telah mengalami perkembangan
dalam beberapa tahun terakhir. Tujuan isolasi dan pemurnian metabolit
sekunder yaitu menemukan metode yang tepat yang dapat menarik senyawa
yang memiliki aktivitas seperti antioksidan, antibakteri, atau sitotoksisitas.
Metode in vitro merupakan metode yang lebih banyak dipakai daripada in
vivo sebab penelitian memakai hewan coba relatif mahal, membutuhkan
lebih banyak waktu, dan adanya kontroversi etis terhadap hewan coba.
Fraksinasi
Frakasinasi yaitu proses pemisahan metabolit sekunder dalam bentuk ekstrak
menjadi fraksi-fraksi, atau dapat juga didefinisikan sebagai proses pemisahan
senyawa melibatkan pembagian campuran menjadi beberapa fraksi. Beberapa
fraksi dapat digolongkan berdasar dari kelarutan senyawa terhadap pelarut
dengan tingkat kepolaran yang sama atau berdekatan. Fraksinasi senyawa
dapat dilakukan memakai metode kromatografi. Metode kromatografi
memiliki prinsip kerja di mana distribusi dari komponen-komponen campuran
ini antara tahap gerak berupa pelarut yang berfungsi membawa senyawa
dengan kepolarannya sama melewati tahap diam yang berfungsi sebagai
adsorben. Syarat bahan dapat dipakai menjadi adsorben yaitu bahan
bersifat inert dan tidak bereaksi dengan sampel atau tahap gerak dan tidak larut
dalam tahap gerak contohnya silika, selulosa, stirena, divinilbenzena, alumina,
dan karbon
Tahapan fraksinasi umumnya memakai metode kromatografi kolom
(KKG), kromatografi lapis tipis (KLT), High Pressure Liquid
Chromatography (HPLC), dan Gas Chromatography (GC). Pemurnian dan
identifikasi senyawa merupakan tahapan akhir dalam teknik isolasi dan efektif
untuk pemurnian senyawa metabolit sekunder yaitu kristalisasi dan
rekristalisasi. Teknik kromatografi kolom dipakai untuk proses isolasi dan
pemurnian senyawa bioaktif. Adapula instrumen yang telah dikembangkan
seperti High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) yang dipakai untuk
mempercepat proses pemurnian molekul bioaktif. Dilanjutkan dengan
identifikasi senyawa yang telah dimurnikan dapat memakai teknik
spektroskopi seperti UV-visible, Infrared (IR), Nuclear Magnetic Resonance
(NMR), dan spektroskopi massa. Banyak molekul bioaktif yang telah diisolasi
dan dimurnikan memakai metode Kromatografi lapis tipis (KLT) dan
kromatografi kolom.
Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode analisa yang dipakai
untuk memisahkan campuran senyawa dengan tepat dan sederhana. Pemisahan
yang terjadi pada KLT berdasar prinsip adsorpsi, partisi atau kombinasi,
tergantung pada jenis lempeng (tahap diam) dan gerak yang dipakai . Pada
umumnya, KLT dipakai dengan tujuan untuk identifikasi senyawa sebab
metode ini sederhana dan mudah, serta memberi pilihan tahap gerak yang
lebih beragam. Manfaat lainnya yaitu untuk analisa kuantitatif dan isolasi
skala kecil. Lempeng kaca atau aluminium dipakai sebagai tahap diam. tahap
gerak akan bergerak di sepanjang tahap diam dan terbentuklah kromatogram,
yang dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka.
Pada tahap diam pada dasarnya jenis padatan yang dipakai yaitu:
1. Silica gel: asam amino, alkaloid, asam lemak dan lain-lain,
2. Alumina: alkaloid, zat warna, fenol dan lainnya,
3. Selulosa: asam amino, alkanoid dan lain-lain.
Komponen KLT yaitu tahap diam dan tahap gerak selalu dipakai secara
bersama ketika proses kromatografi sedang berjalan melalui kesetimbangan
yang melibatkan lapisan adsorben, pelarut, dan uap pelarut.
Syarat pelarut yang dapat dipakai dalam KLT yaitu:
1. Pelarut harus dalam bentuk yang sangat murni dan harganya
terjangkau
2. Inert dan tidak bereaksi dengan komponen dalam sampel maupun
material pada tahap diam
3. Memiliki viskositas dan tegangan permukaan sesuai kriteria
4. Memiliki titik didih yang rendah untuk memudahkan pengeringan
setelah selesai proses KLT
5. memiliki kelarutan yang baik pada berbagai campuran solvent
6. Tidak beracun dan mudah penanganan limbahnya
Bagian-bagian dari alat kromatografi lapis tipis antara lain:
1. Lempengan kromatologi,
Lempeng terbuat dari aluminium atau kaca dengan ukuran standar 20
x 20 cm, tebal lapisan 0,10-0,25 mm. Lempeng yang siap dipakai
banyak tersedia di pasaran, atau dapat disiapkan sendiri. Untuk
keperluan preparatif, lempeng yang dipakai atau dipakai memiliki
ketebalan lappisan hingga 1 mm.
2. Rak penyimpanan
Rak penyimpanan berfungsi untuk meletakkan tahap diam apabila
memerlukan pemanasan untuk mengaktifkan tahap diam.
3. Bejana Kromatografi.
Bejana ini diperuntukkan meletakkan tahap diam dalam posisi tegak,
bagian bawahnya datar, tempat sejumlah tahap gerak, sedangkan
bagian atasnya dapat ditutup dengan rapat. Ukuran bejana yang akan
dipakai disesuaikan dengan ukuran lempeng yang dipakai .
Sebelum proses KLT dilakukan, memerlukan penjenuhan bejana
terlebih dahulu yang bertujuan untuk memperoleh pemisahan yang
baik.
4. Mikro pipet (micro-syrige).
Mikro pipet dipakai untuk menotolkan larutan sampel dan larutan
pembanding dalam jumlah yang dihendaki, contohnya 10 atau 20 µl,
dan volume lainnya.
5. Alat penyemprot larutan deteksi.
Alat ini umumnya terbuat dari kaca dan dipakai untuk
menyemprotkan pereaksi atau larutan deteksi ke lempeng atau tahap
diam. Larutan yang keluar dalam bentuk butir-butir halus.
6. Lampu UV
Lampu UV dipakai untuk melakukan pengamatan hasil KLT pada
panjang gelombang 254 nm dan atau 366 nm
3.6.3 Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan salah satu metode pemisahan senyawa yang
masih sering dipakai . Senyawa yang dipisahkan memakai
kromatografi kolom memiliki prinsip kerja yang sama dengan metode
kromatografi lainnya yaitu berkaitan dengan perbedaan antara gaya-gaya antar
molekul dalam sampel dengan tahap gerak dan antara komponen dengan tahap
diam. Kromatografi kolom dilakukan berdasar adsorbsi senyawa pada
suatu campuran yang memiliki anfinitas berbeda-beda pada permukaan tahap
diam atau penjerap. tahap gerak yang dialirkan akan melarutkan dan membawa
komponen-komponen dalam campuran dengan kecepatan yang berbeda sesuai
dengan afinitas masing-masing komponen terhadap penjerat.
Kromatografi kolom biasanya dipakai untuk memisahkan suatu campuran
senyawa dalm jumlah relatif banyak, tergantung diameter dan panjang kolom
yang dipakai . Hal yang dapat memengaruhi keberhasilan pemisahan
dengan memakai kromatografi kolom yaitu pemilihan adsorben dan
eluen atau pelarut yang tepat, dimensi kolom yang dipakai serta kecepatan
elusinya. Kecepatan laju alir atau elusi sebaiknya dibuat konstan. Kecepatan
laju alir ini harus cukup lambat agar senyawa berada dalam
keseimbangan antara tahap diam dan tahap gerak. Kolom konsentrasi pada tahap
gerak dan tahap diam akan menyebar secara homogen walau masih bergantung
pada sifat fiika dan kimia masing-masing komponen.
Peralatan yang dipakai dalam kromatografi kolom, antara lain:
1. Tabung atau kolom kaca yang memiliki ukuran tertentu dan
lubang untuk keluarnya tahap gerak setelah melewati tahap diam.
Kecepatan alir tahap gerak dapat diatur menyesuaikan dengan
kebutuhan. Kolom berisi tahap diam yang sudah siap dipakai dan
terendam dalam suatu pelarut organik.
2. Besar dan volume tempat penampungan tahap gerak yang keluar yang
dipakai harus disesuaikan dengan setiap volume yang
dikehendaki.
3. Alat kromatografi lapis tipis (KLT) yang dipakai untuk
mendeteksi senyawa harus berada dalam tempat penampung
3.6.4 Kromatografi Gas-Cair
Kromatografi gas merupakan metode yang dipakai untuk pemisahan
campuran berdasar perbedaan koefisien partisi dari senyawa yang diuapkan
antara tahap cair dan tahap gas yang dilewatkan dalam kolom dengan bantuan
gas. Kromatografi gas-cair (gas liquid chromatography) memakai tahap
diam berupa lapisan tipis zat cair pada zat padat yang inert, sedangkan
kromatografi gas-padat (gas solid chromatography) memakai tahap diam
berupa zat padat yang aktif, seperti alumina dan silika gel. Senyawa yang
mudah menguap akan masuk ke dalam kolom, kemudian terdistribusi pada
tahap gas dan tahap cair atau padat, resolusi pada kromatografi gas ditentukan
oleh efisiensi kolom dan tahap gerak. Kolom memengaruhi lebar puncak, dan
pelarut menentukan letak puncak kromatogram. pemakaian kromatografi gas
untuk identifikasi suatu senyawa harus disertai dengan larutan pembanding
yang memiliki waktu retensi yang sama dengan senyawa yang dianalisis.
Analisa kuantitatif dilakukan dengan memakai ukuran luas puncak.
Peralatan yang dipakai pada kromatografi gas dan cair, antara lain:
1. Silender.
Merupakan tempat gas pembawa atau tahap gerak, yang dilengkapi
dengan katup pengatur tekanan, seperti helium, nitrogen atau gas
inert lain.
2. Injektor atau alat suntik
dipakai untuk memasukkan sampel ke dalam kolom. Supaya
sampel berbentuk uap, maka tempat penyuntikan harus dipanaskan
terlebih dahulu dengan suhu yang cukup tinggi agar cepat terjadi
penguapan, namun jangan memakai suhu yang terlalu tinggi
sehingga tidak memicu bahan terurai.
3. Kolom
Terbuat dari kaca atau logam yang tahan karat, ditempatkan pada
kotak pemanas yang suhunya dapat diatur dan dipertahankan dalam
waktu tertentu. Pengaturan suhu bertujuan agar eluasi senyawa
berjalan dengan efisien sehingga komponen senyawa dapat keluar
dari kolom secara terpisah.
4. Alat alir gas
Alat ini difungsikan untuk mengatur laju alir tahap gerak. Laju alir gas
yang keluar dari kolom dihitung, dan umumnya dinyatakan dalam
ml/menit pada tekanan atmosfer dan suhu kamar.
5. Detektor
Detektor haruslah dipilih yang memiliki kepekaan tinggi dan selektif.
Umumnya dipakai detektor ionisasi nyala dengan gas tahap gerak
helium atau nitrogen
High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC)
High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT) yaitu alat yang dipakai dalam pemisahan, sebagai
hasil proses partisi, adsorpsi, atau penukaran ion, tergantung pada jenis tahap
diam yang dipakai . HPLC merupakan alat yang memiliki kepekaan tinggi,
serta dapat dipakai untuk analisa kualitatif dan kuantitatif secara bersamaan.
Teknologi kolom ini memerlukan sistem pompa tekanan tinggi yang mampu
mengalirkan tahap gerak pada tekanan tinggi hingga 300 atmosfer. Jumlah
sampel yang akan dipisahkan dengan kromatografi hanya memerlukan sekitar
20 µg. Prinsip identifikasi senyawa memakai KCKT pada dasarnya sama
dengan yang dipakai pada kromatografi gas. Pada KCKT diperlukan tahap
gerak berkualitas tinggi dan sebaiknya sebelum dipakai, harus dihilangkan
terlebih dahulu kandungan gas yang mungkin terkandung di dalamnya. Jenis
dan komposisi tahap gerak memengaruhi kinerja kromatografi dan resolusi
senyawa dalam camuran bahan uji.
Selama proses pemisahan berlangsung, komposisi pelarut dapat diubah secara
berkesinambungan atau yang disebut juga dengan eluasi gradien atau
pengaturan pelarut. Kelebihan dari metode HPLC yaitu mampu memisahkan
suatu senyawa dari suatu campuran, mudah dalam pengerjaannya, kecepatan
analisa dan kepekaan yang tinggi, dapat menghindari terjadiya dekomposisi
atau kerusakan sampel yang akan dianalisis, resolusinya baik, dapat
memakai bermacam-macam detektor, kolom dapat dipakai kembali,
dan mudah melakukan “sample recorvery”.
Peralatan yang dipakai dalam kromatografi cair kinerja tinggi , antara lain:
1. Pompa
dipakai ntuk mengalirkan fese gerak dari tempatnya ke dalam
kolom dengan pipa yang memiliki tekanan tinggi. Umumnya tekanan
hingga 5000 psi dengan laju alir yang dapat disesuaikan, kurang lebih
10 ml/menit.
2. Injektor
Alat ini merupakan tempat untuk memasukkan larutan sampel, dapat
dioperasikan secara manual atau otomatis. Larutan sampel harus
disaring terlebih dahulu sebelum disuntukkan ke injektor.
3. Kolom
Kolom memiliki ukuran diameter 2-5 mm dan berisi tahap diam. Ada
dua jenis fae diam yaitu tahap diam bersifat polar (tahap normal) dan
non polar (tahap terbalik). tahap gerak merupakan campuran pelarut
dengan polaritas tertentu yang dapat diatur sesuai keperluan, dengan
cara mengubah komposisinya. Untuk tujuan preparatif, kolom yang
dipakai memiliki diameter lebih besar.
4. Detektor.
Spektrofotometer merupakan alat detektor yang umum dipakai .
Alat ini ada pada bagian akhir kolom. Radiasi sinar uv akan
melewati suatu sel menuju detektor. Sampel yang dianalisis setelah
melewati kolom masuk ke dalam sel untuk menyerap radiasi, dan
menghailkan perubahan tingkat energi yang dapat diukur.
5. Pengumpul data.
Alat ini dipakai untuk mengumpulkan data yang merupakan
kromatografi lengkap dengan tinggi dan luas puncak, identifikasi
bahan uji dan variabel metode.
Rekristalisasi
Rekristalisasi merupakan senyawa organik yang berupa padatan hasil dari
isolasi bahan alam dengan kemurnian yang relatif rendah. Umumnya senyawa
ini masih mengandung senyawa lain yang jumlahnya lebih sedikit, yang
dihasilkan selama proses isolasi. Proses pemurnian senyawa biasanya melalui
tahapan rekristalisasi dari pelarut yang sesuai atau campuran beberapa pelarut.
Pemurnian senyawa padatan berdasar perbedaan kelarutan pada pelarut
maupun campuran pelarut.
Proses rekristalisasi (J.P. Cannell, 1998) terdiri dari beberapa tahap di
antaranya yaitu:
1. Melarutkan bahan dalam pelarut yang sesuai hingga larut sempurna,
dapat juga dibantu dengan pemanasan.
2. Dinginkan atau ditetesi dengan pelarut yang tidak melarutkan
senyawa agar mendapatkan kristal kembali yang terpisah dari larutan
induk. Proses ini dilakukan berulang-ulang memakai pelarut
baru sampai didapatkan senyawa dalam keadaan murni.
Jika bahan tidak dapat melarut dalam satu pelarut maupun beberapa pelarut,
maka campuran beberapa pelarut dengan komposisi tertentu dapat dipakai
dengan catatan pelarut ini harus saling larut. Selanjutnya padatan hasil
rekristalisasi dikeringkan dan dilakukan uji kemurnian memakai
penentuan titik leleh, uji KLT dengan 3 campuran eluen yang berbeda,
kemudian dilakukan penentuan struktur dengan metode spektroskopi.
Analisis Metabolit Sekunder
Penapisan Fitokimia
Penapisan fitokimia dengan metode kualitatif merupakan metode penapisan
fitokimia yang dilakukan dengan melihat reaksi pengujian warna dengan
memakai suatu pereaksi warna. Menurut Yuhernita dan Juniarti (2011),
hal utama yang berperan penting dalam penapisan fitokimia yaitu pemilihan
pelarut dan metode ekstraksi. Penapisan fitokimia dapat dilakukan terhadap
beberapa senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tujuan pengujian.
4.1.1 Identifikasi Flavonoid
Identifikasi flavonoid senyawa metabolit sekunder dapat dilakukan
memakai beberapa pengujian, antara lain uji reagen alkalin dan uji
Shinoda. Uji Alkalin dilakukan dengan menambahkan larutan NaOH dan HCl,
sednagkan uji Sinoda dilakukan dengan menambahkan alkohol, logam
magnesium, dan larutan HCl. Uji reagen alkalin dan Shinoda akan
menghasilkan perubahan warna yang spesifik untuk menunjukkan keberadaan
senyawa ini .
Reaksi 1:
Gambar 4.1: Mekanisme Reaksi Uji Shinoda Senyawa Flavonoid (Goud and
Poornima, 2018)
Reaksi 2:
Gambar 4.2: Mekanisme Reaksi Flavonol pada Uji Shinoda (Tandi et al.,
2020)
4.1.2 Identifikasi Tanin
Identifikasi tanin dilakukan dengan penambahan reagen ferri klorida dan
pengujian dengan reagen NaOH. Pada penambahan reagen ferri klorida akan
menghasilkan tanin terhidrolisa yang berwarna warna biru atau biru hitam,
sedangkan reagen NaOH akan menghasilkan pembentukan emulsi dari tanin
terhidrolisa ini .
Reaksi:
Gambar 4.3: Reaksi uji FeCl3 senyawa Tanin
Bab 4 Analisis Metabolit Sekunder 53
4.1.3 Identifikasi Fenolik
Identifikasi fenolik juga dapat dilakukan dengan penambahan reagen ferri
klorida. Hasil positif adanya senyawa fenolik akan memberi warna hijau
tua atau biru kehitaman.
Reaksi:
Gambar 4.4: Reaksi uji FeCl3 senyawa fenolik (Goud and Poornima, 2018)
4.1.4 Identifikasi Alkaloid
Identifikasi alkaloid senyawa metabolit sekunder dapat dilakukan
memakai beberapa pengujian, antara lain uji Dragendorf, uji Mayer, uji
Hager, uji Wagner, uji Iodin, uji Asam Pikrat, uji Asam Tanat. Masing-masing
pengujian menghasilkan perubahan warna yang spesifik sesuai reagen yang
dipakai
Reaksi:
Gambar 4.5: Reaksi senyawa alkaloid dengan Reagen Mayer (a), Wagner (b),
Dragendorf (c)
Identifikasi Terpenoid
Identifikasi senyawa terpenoid dengan uji Salkowski dilakukan dengan
menambahkan pelarut kloroform dan reagen asam sulfat. Adanya senyawa
terpenoid ditandai dengan pembentukan endapan berwarna merah kecoklatan
Identifikasi Saponin
Identifikasi saponin dilakukan dengan menambahkan air pada ekstrak,
kemudian digojok beberapa saat sampai menghasilkan busa homogen.
Pengujian lain senyawa saponin dapat ditambahkan dengan olive oil yang
ditandai dengan pembentukan emulsi (
Kromatografi Lapis Tipis dan Kertas
Pengertian Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan
Kromatografi Kertas (KK)
Kromatografi Lapis Tipis dan Kromatografi Kertas merupakan salah satu jenis
kromatografi yang masih banyak dipakai , merupakan suatu teknik
pemisahan secara fisika komponen-komponen berdasar dua tahap , yaitu tahap
gerak (mobile phase) dan tahap diam (stationary phase). Kromatografi Lapis
Tipis dan Kromatografi Kertas merupakan jenis kromatografi planar, yang
dipakai untuk mengidentifikasi suatu sampel. Prinsip pemisahan yang
terjadi pada teknik KLT dan KK memiliki persamaan yaitu adanya
distribusi differential komponen sampel di antara tahap diam dan tahap gerak,
berdasar sifat kepolaran dari sampel ini .
tahap Diam dan tahap Gerak yang dipakai
1. tahap Diam
Pemilihan tahap diam pada KLT didasarkan pada sifat fisika kimia
komponen sampel yang akan dipisahkan meliputi polaritas, kelarutan,
kemampuan mengion, berat molekul, bentuk dan ukuran analit. Sifat
fisika kimia ini berperan penting dalam menentukan mekanisme
pemisahan dalam KLT. Sorben tahap diam pada KLT dapat berupa
senyawa anorganik maupun organik. Sorben anorganik misalnya
alumunium oksida, silikon oksida, magnesium karbonat, kalsium
karbonat, dan lain-lain. Sedangkan sorben organik misalnya pati dan
selulosa. Partikel-partikel sorben berbentuk butiran halus ini
dilapiskan pada penyangga padat seperti pelat kaca, plastik atau
alumunium. Silika gel yaitu sorben yang paling populer (64%),
diikuti oleh selulosa (9%), dan alumina (3%). tahap diam pada
Kromatografi Kertas memakai air yang terikat pada selulosa
kertas.
2. tahap Gerak
Pemilihan tahap gerak yang dipakai pada KLT dan KK memiliki
prinsip yang sama, yaitu memakai campuran 2 atau lebih pelarut
yang memiliki tingkat kepolaran yang berbeda-beda. Eluen juga
harus memenuhi persyaratan sebagai berikut:
a. Memiliki kemurnian yang tinggi
b. Stabil
c. Memiliki viskositas rendah,
d. Memiliki partisi isotermal yang linier,
e. Tekanan uap yang tidak terlalu rendah atau tidak terlalu tinggi,
f. Toksisitas serendah mungkin
Dalam pemilihan tahap gerak bisa dipilih berdasar pustaka, bisa juga dengan
dilakukan optimasi, mencoba-coba dua pelarut yang berbeda-beda
kepolarannya, sehingga didapatkan hasil Rf berkisar antara 0,2-0,8. Beberapa
jenis pelarut yang sering dipakai sebagai tahap gerak pada KLT dan KK
yaitu : Heksana, Isobutanol, Etanol, etilasetat, kloform, toluene, isopropanol.
Sistem tahap gerak dalam KLT biasanya memakai dua pelarut atau lebih,
seperti BAA (n-Butanol:Asam asetat: Air) untuk pemisahan senyawa
flavonoid pada crude ekstrak
Tahapan Prosedur pada Analisis dengan KLT dan KK
Pada metode analisis KLT, beberapa persiapan harus dipenuhi untuk
mendapatkan hasil pemisahan sampel yang baik meliputi preparasi sampel,
penanganan lempeng KLT, penanganan eluen, penanganan chamber tempat
elusi, aplikasi sampel, proses pengembangan sampel dan evaluasi noda.
1. Preparasi Sampel
Sebelum melakukan preparasi sampel terlebih dahulu ditentukan
jenis sampel dan sifat fisika kimia analit yang akan dianalisis. Prinsip
dari preparasi yang dilakukan yaitu agar diperoleh smpel dalam
keadaan terlarut dan jernih. Pelarut yang dipakai diusahakan
merupakan pelarut yang mudah menguap, agar setelah penotolan
akan segera kering. Jika sampel yang dipakai belum dalam
keadaan terlarut, maka dapat dilakukan penggojokan sehingga
terpisah filtrat dan residunya, sedangkan untuk mendapatkan sampel
yang jernih maka perlu dilakukan proses penyaringan.
2. Penanganan Lempeng KLT dan Kertas KK
Sebelum memakai lempeng KLT, pastikan dulu jenis lempeng
yang dipakai , sehingga tidak terjadi kesalahan penanganan
lempeng. Lempeng KLT bersifat rapuh dan harus ditangani dengan
benar mulai dari pembukaan kemasan sampai ke tahap dokumentasi.
Pendukung sorben yang paling umum dipakai pada lempeng KLT
yaitu aluminium foil, film plastik dan piring kaca. Lempeng
ini dipakai untuk berbagai tujuan dan penanganan masing-
masing jenis pendukung sorben berbeda-beda. Film plastik jarang
dipakai sebab tidak tahan pemanasan. Pendukung sorben yang
banyak dipakai yaitu aluminium foil. Sebelum dipakai ,
lempeng KLT harus dilakukan proses pencucian, pengaktivasian,
pengkondisian serta impregnansi (tergantung dari jenis sampel yang
dianalisis). Pemotongan lempeng KLT dan Kertas Saring untuk KK,
dapat memakai gunting. Pada saat menggunting, jangan
memegang bagian atas (sorben), sebab akan memicu
kontaminasi pada lempeng KLT. Ukuran lempeng yang dipakai
disesuiakan dengan ukuran chamber yang akan dipakai . Lempeng
KLT dan kertas yang dipakai diberikan tanda batas bawah, sebagai
titik penotolan sampel dan batas atas sebagai batas pengembangan
(elusi) tahap gerajk.
3. Penanganan tahap Gerak
Pemilihan tahap gerak yang tepat dapat dilakukan melalui optimasi,
terhadap beberapa pelarut yang akan dipakai . Setelah ditemukan
tahap gerak yang sesuai, yang menghasilkan nilai Rf 0,2-0,8, serta
dapat memisahkan sampel yang terdiri lebih dari satu dengan baik
(yang ditandai efisiensi kromatogram yang dihasilkan), maka langkah
selanjutnya yaitu melakukan penjenuhan chamber dengan tahap
gerak yang telah ditentukan. Penjenuhan chamber bertujuan untuk
menyamaratakan tekanan uap dari tahap gerak yang dipakai
sehingga pemisahan dapat berjalan dengan baik.
Penjenuhan chamber dilakukan dengan melapisi dinding bagian
dalam chamber kromatografi dengan kertas saring, sekurang-
kurangnya setengah keliling chamber dan kertas saring hampir
mencapai bagian atas bejana. Hal lain yang harus diperhatikan
didalam penyiapan tahap gerak ini yaitu menyiapkan chamber yang
dipakai , harus dalam keadaan kering (bebas dari air) dan bersih
(bebas dari kotoran). Adanya pengotor dan air dalam chamber akan
menggangu kromatogram yang dihasilkan dan memengaruhi
reprodusibilitas pemisahan KLT.
4. Penotolan Sampel
Penotolan sampel sangat berpengaruh terhadap hasil KLT. Pemisahan
pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika
menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit
mungkin. jika sampel yang dipakai terlalu banyak maka akan
menurunkan resolusi dan akan memicu tailing (bercak yang
berekor). Aplikasi sampel pada sorben lempeng KLT dapat dilakukan
secara manual dengan peralatan sederhana dan dapat juga dengan
peralatan otomatis. Semakin tepat posisi penotolan dan kecepatan
penotolan semakin baik kromatogram yang dihasilkan. Aplikasi
sampel secara otomatis dapat memperbaiki kualitas penotolan
sampel. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penotolan sampel
secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan secara manual
terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 µl. Penotolan
sampel yang tidak tepat akan memicu bercak menyebar dan
puncak ganda. Volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 µl
untuk memperoleh reprodusibilitas. Jika volume sampel yang
ditotolkan lebih dari 2-10 µl maka penotolan harus dilakukan secara
bertahap dengan pengeringan antar totolan.
5. Elusi (Pengembangan)
Elusi atau pengembangan KLT dipengaruhi oleh chamber yang
dipakai dan kejenuhan dalam bejana (chamber). Metode
pengembangan yang dipilih tergantung tujuan analisis yang ingin
dicapai dan ketersediaan alat di laboratorium. Metode elusi yang
paling banyak dipakai yaitu metode pengembangan satu dimensi
linier. Metode pengembangan linier yang paling sering dipakai
yaitu metode pengembangan menaik (ascending). Metode ini
ilakukan dengan cara memasukkan eluen dalam chamber, setelah
chamber jenuh, ujung lempeng bagian bawah direndam ke dalam
eluen dalam chamber. Eluen bermigrasi dari bawah lempeng menuju
keatas dengan gaya kapilaritas.
Beberapa hal yang perlu diperhatikan didalam melakukan elusi secara
menaik:
a. Selama pengembangan, chamber harus berada diatas bidang yang
datar, permukaan chamber juga harus sejajar (tidak miring), dan
pastikan selama pengembangan tidak terganggu oleh hal-hal yang
tidak diinginkan.
b. Selama pengembangan, dalam keadaan apapun tidak
diperkenankan menggerakkan chamber untuk mengamati proses
pengembangan
c. Selama pengembangan juga tidak diperkenankan membuka tutup
chamber untuk melihat garis depan eluen
Gambar 4.6: Elusi senyawa metabolit pada KLT
6. Deteksi Bercak
Hasil yang diperoleh pada metode KLT dan KK setelah proses elusi
yaitu berupa bercak pada Lempeng KLT dan Kertas yang
dipakai . Bercak yang didapatkan dapat berupa bercak yang
berwarna maupun tidak berwarna sesuai dengan sampel yang
dianalisis. Pada deteksi bercak yang berwarna, dapat langsung
diketahui secara visualisasi langsung, sedangkan pada deteksi bercak
yang tidak berwarna, deteksi bercak dapat dilakukan dengan dua
cara, yaitu:
a. memakai bahan ber-fluoresensi
Lempeng KLT biasanya ditambahkan bahan yang dapat
menghasilkan fluoresensi (pendaran). Ketika lempeng disinari
dengan lampu UV (ultraviolet) akan memicu lempeng
ini berpendar. Pada saat lempeng ini berpendar,
bercak-bercak terlihat gelap dan selanjutnya bercak-bercak
ini dapat ditandai sebagai hasil elusi KLT. Sinar UV yang
dipakai pada analisis bercak yaitu UV254 dan UV366 nm.
b. Penunjukkan bercak secara kimia
Langkah lain yang dapat dilakukan untuk menegaskan bercak
hasil elusi dapat memakai penampak bercak dari reagen
kimia. Reagen kimia ini sering dipakai untuk menegaskan
bercak hasil KLT senyawa metabolit sekunder secara spesifik
seperti flavonoid, alkaloid, fenolik, steroid, antrakinon. Setelah
proses elusi selesai, plat KLT dikeringkan kemudian disemprot
dengan reagen kimia yang sesuai dengan senyawa metabolit
sekunder yang diamati. Salah satu aplikasi pemakaian reagen
kimia pada penegasan bercak yaitu pemakaian sitoborat,
H2SO4, dan uap amoniak untuk flavonoid.
Reagen sitroborat dipakai untuk mendeteksi adanya senyawa
flavonoid pada suatu sampel. Warna kuning yang terdeteksi pada
ekstrak kasar, fraksi larut etanol, dan fraksi n-heksan yaitu diduga
merupakan flavonoid jenis flavanon dan flavon yang ada
pada rimpang temu kunci. Flavonoid menghasilkan peredaman
fluorosensi pada sinar UV254 nm dan menunjukkan fluorosensi
kuning, hijau, atau biru.
Penampakan noda lainnya memakai pereaksi semprot H2SO4
yang menghasilkan bercak berwarna coklat kehitaman. Hal
ini berdasar kemampuan asam sulfat yang bersifat
reduktor dalam merusak gugus kromofor dari zat aktif simplisia
sehingga panjang gelombangnya akan bergeser ke arah yang
lebih panjang (UV menjadi Vis) sehingga noda menjadi tampak
oleh mata. Selain reagen sitoborat dan H2SO4 penampak noda
pada flavonoid dapar memakai uap amonika. Hal ini sesuai
dengan teori bahwa noda yang tampak setelah diberi perlakuan
diuapi dengan amoniak akan terbentuk noda dengan fluoresensi
kuning, biru lembayung, kuning redup, kuning pucat, hijau
kehitaman, jingga, dan merah.
Tabel 4.2: Pereaksi bercak beberapa senyawa metabolit sekunder
No. Jenis Pereaksi Senyawa
1 Dragendrof Alkaloid
2 Liebarman Burchard Steroid
3 KOH 10% metanolik Antrakinon
4 Sitoborat Flavonoid
5 AlCl3 Fenolik
7. Interpretasi Hasil Analisis dengan Metode KLT dan KK
Analsis dengan metode KLT dan KK dapat dipakai untuk tujuan
analisis kualitatif maupun analisis kuantitatif. Interpretasi hasil
analisis memakai bercak yang diperoleh setelah proses elusi.
Bercak yang diperoleh diolah lebih lanjut, berdasar tujuan analisis
yang diinginkan.
Gambar 4.7: Interpretasi Hasil Spotting Sampel yang Dianalisis
8. Analisis Kualitatif
Pada analisis kualitatif, bercak yang diperoleh dilakukan perhitungan
lebih lanjut yang dinamakan dengan nilai Rf (Retardation Factor).
Nilai Rf ini dipakai sebagai nilai perbandingan relatif antar
sampel. Selain itu, nilai Rf juga dipakai sebagai derajat resisten
62
sebuah komponen dalam tahap diam sehingga nilai Rf juga sering
disebut dengan faktor retensi. Rumus menghitung nilai Rf yaitu:
Semakin besar nilai Rf sampel maka semakin besar jarak gerak
senyawa pada plat kromatografi lapis tipis. Ketika membandingkan
dua sampel berbeda di kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan
besar jika senayaea kurang polar dan berinteraksi dengan adsorben
polar dari plat kromatografi ini . Faktor-faktor yang
memicu nilai Rf bervariasi meliputi dimensi dan jenis ruang,
sifat dan ukuran lempeng, arah aliran tahap gerak, volume dan
komposisi tahap gerak, kondisi kesetimbangan, kelembaban, dan
metode persiapan sampel KLT sebelumnya.
Setelah didapatkan hasil Rf, maka kesimpulan adanya kandungan
suatu senyawa dalam sampel dilakukan dengan cara:
a. Analisis memakai Larutan Baku
Analisis ini dilakukan dengan membandingkan nilai Rf sampel,
dibandingkan dengan nilai Rf baku yang dipakai . Nilai Rf bisa
dijadikan bukti untuk mengidentifikasi senyawa. Jika identifikasi
Rf sampel dan baku bernilai sama maka senyawa ini
dikatakan memiliki karakteristik yng sama/mirip. Sebaliknya,
jika nilai Rf berbeda berarti senyawa yang berbeda.
b. Analisis tidak memakai Larutan Baku
Analisis ini dilakukan dengan membandingkan nilai Rf sampel,
dibandingkan dengan Rf yang ada pada pustaka (Jurnal atau
Handbook) sebagai acuan. Nilai Rf yang dihasilkan harus sama
atau mendekati dengan Rf yang ada pada pustaka ini .
Syarat untuk memakai pustaka sebagai acuan Rf, maka
kondisi percobaan (jenis tahap gerak, volume chamber), harus
sama dengan yang ada pada pustaka ini .
c. Analisis Kuantitatif
Beberapa metode yang dipakai untuk tujuan analisis
kuantitatif yaitu sebagai berikut:
1) Metode langsung
Untuk analisa kuantitatif yang sederhana berupa
perbandingan visual intensitas noda jumlah sampel dengan
noda standar yang dikembangkan secara bersamaan.
2) Metode Ekstraksi Noda
Metode ini meliputi tahapan pengeringan lempeng,
penandaan noda analit, memotong bagian lempeng yang
mengandung analit, mengumpulkan sorben, ekstraksi analit
dari sorben, dan pengukuran dengan dibandingkan standar
secara mikroanalitikal, seperti absorpsi larutan atau
spektrofotometri fluoresensi.
3) Metode KLT-Densitometri
Pada metode ini, lempeng KLT yang sudah dielusi langsung
dianalisis memakai instrument Densitometer atau TLC
scanner. Penentuan kualitatif analit KLT-Densitometri
dilakukan dengan cara membandingkan Rf analit dan standar.
Adapun parameter kuantitatif yang dipakai yaitu tinggi
puncak kurva densitometri dan area di bawah puncak kurva
densitometri dari bercak yang didapatkan pada metode KLT.
Densitometri merupakan analisis instrumental yang
didasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan
analit berupa bercak hasil KLT. Interaksi radiasi
elektromagnetik dengan noda KLT yang ditentukan yaitu
absorpsi, transmisi, pantulan (refleksi) pendar fluor atau
pemadaman pendar fluor dari radiasi semula. Densitometri
juga merupakan metode penetapan kadar suatu senyawa pada
lempeng kromatografi yang pengukurannya dilakukan
dengan cara mengukur serapan analit di mana cahaya yang
diukur dapat berupa cahaya yang dipantulkan atau
diteruskan, pemadaman fluoresensi analit atau hasil reaksi
analit
4.3 Analisis Kuantitatif
4.3.1 Analisis Kuantitatif secara Spektrofotometri
Analisis spektrofotometri merupakan analisis kimia yang didasarkan pada
pengukuran intensitas warna larutan yang akan ditentukan konsentrasinya
dibandingkan dengan larutan standar, yaitu larutan yang telah diketahui
konsentrasinya. Penentuan konsentrasi didasarkan pada absorpsimetri, yaitu
metode analisis kimia yang didasarkan pada pengukuran absorpsi (serapan)
radiasi gelombang elektromagnetik. Metode spektrofotometri didasarkan pada
absorpsi radiasi elektromagnet. Cahaya ini merupakan radiasi yang sesuai
dengan kepekaan mata manusia. akan menyusun cahaya putih. Cahaya putih
akan meliputi seluruh spetrkum ultraviolet sampai tampak pada panjang
gelombang 200-800 nm.
Pada teknik spektrofotometri, cahaya dari sumber cahaya diuraikan dengan
memakai prisma sehingga diperoleh cahaya monokromatis (cahaya
dengan satu warna dan satu panjang gelombang) yang diserap oleh zat yang
diserap oleh larutan dapat diukur. Hubungan antara konsentrasi dengan cahaya
yang diserap dinyatakn dengan hokum Lambert-Beer yang menyatakan
“Pengurangan intensitas cahaya monokromatis yang melalui suatu larutan
berwarna berlangsung secara eksponensial dan bergantung pada panjang
larutan yang dilalui cahaya dan kadar zat dalam larutan. Teknik
spektrofotometri telah lama dipakai sebagai suatu teknik yang handal untuk
mendeteksi, identifikasi dan pengukuran kadar suatu senyawa kimia dalam
larutan tertentu. Teknik ini didasarkan pada bahan kimia dapat menyerap dan
menghantarkan cahaya. Suatu larutan memiliki warna tertentu sebab
larutan ini dapat menyerap semua warna kecuali warna yang dapat ditangkap
oleh mata.
Spektrofotometer UV-Vis yaitu pengukuran panjang gelombang dan
intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel.
Sinar ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk
mempromosikan elektron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi.
Spektrofotometer UV-Vis biasanya dipakai untuk molekul dan ion
anorganik atau kompleks di dalam larutan. Spektrum UV-Vis memiliki
bentuk yang lebar dan hanya sedikit informasi tentang struktur yang bisa
didapatkan dari spektrum ini. namun spektrum ini sangat berguna untuk
pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa
ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu
dengan memakai hukum Lambert-Beer.
Hukum Lambert-Beer akan menghasilkan persamaan sebagai berikut:
Keterangan:
I: Intensitas cahaya keluar
I0: Intensitas cahaya masuk
k: Konstanta yang didasarkan pada sifat zat dalam larutan
c: Konsentrasi zat ini
l: Panjang larutan yang dilalui cahaya
Pada alat spektrofotometer UV-Vis, sinar yang datang benar-benar diusahakan
berupa sinar monokromatis dengan cara mempersiapkan kuvet sedemikian
rupa, sehingga tidak ada sinar yang tertahan. Jika jalur sinar pada setiap bagian
kuvet sama, maka nilai k untuk berbagai senyawa dalam berbagai larutan dan
berbagai panjang gelombang dpat dihitung. Bila konsentrasi dalam mol/L,
jarak tempuh cahaya dalam cm, maka nilai k disebut koefisien ekstinsi molar.
Koefisien ekstinsi pada masing-masing alat dapat dihitung pada tabel indeks.
Kadar suatu zat dengan membuat satu atau rangkaian larutan standar dapat
diperiksa. Sampel dengan jumlah sedikit dipakai satu larutan standar dan
kadar zat ditentukan dengan cara membandingkan absorbansi standar (larutan
baku) dengan absorbansi sampel. Sedangkan sampel dengan jumlah banyak
ditentukan dengan membuat serangkaian larutan standar sehingga dapat dibaut
suatu kurva kalibrasi standar. Dengan demikian, kadar sampel yang tidak
diketahui dapat ditentukan dari kurva standar ini
.jpg)
