g DNA yang ditunjukkan di sini tidak dapat berputar secara bebas
relatif satu sama lain, dan molekul protein diasumsikan juga dicegah agar
tidak berputar bebas saat bergerak. Dalam kondisi ini, pergerakan protein
menyebabkan kelebihan heliks untuk menumpuk di heliks DNA di
depan protein dan defisit heliks untuk muncul di DNA di belakang
protein, seperti yang ditunjukkan.
Setiap protein yang mendorong dirinya sendiri di
sepanjang untai DNA heliks ganda cenderung menghasilkan
ketegangan superhelical. Pada eucaryotes, enzim
topoisomerase DNA dengan cepat menghilangkan
ketegangan superhelical ini (lihat hal. 278). namun pada
bakteri topoisomerase khusus yang disebut DNA girase
menggunakan energi hidrolisis ATP untuk memompa
superkoil secara terus-menerus ke dalam DNA, sehingga
mempertahankan DNA di bawah tekanan konstan. Ini
yaitu supercoils negatif, memiliki kebalikan dari supercoils
positif yang terbentuk saat wilayah heliks DNA terbuka
(lihat Gambar 20B). Setiap kali heliks terbuka, ia akan
menghilangkan superkoil negatif ini dari DNA bakteri,
mengurangi ketegangan superhelical. Oleh karena itu, DNA
girase menjadikan pembukaan heliks DNA pada bakteri
lebih menguntungkan dibandingkan dengan pembukaan
heliks pada DNA yang tidak superkoil. Untuk alasan ini,
57
biasanya memfasilitasi proses genetik pada bakteri, termasuk
inisiasi transkripsi oleh bakteri RNA polimerase, yang
membutuhkan pembukaan heliks (lihat Gambar 11).
Perpanjangan Transkripsi Pada Eukariota sangat erat
dengan Pemrosesan RNA
Kita telah melihat bahwa mRNA bakteri disintesis
semata-mata oleh RNA polimerase yang dimulai dan
berhenti pada titik-titik spesifik pada genom. Situasi pada
eucaryotes sangat berbeda. Secara khusus, transkripsi
hanyalah yang pertama dari beberapa langkah yang
diperlukan untuk menghasilkan mRNA. Langkah penting
lainnya yaitu modifikasi kovalen dari ujung RNA dan
penghapusan urutan intron yang dibuang dari tengah
transkrip RNA oleh proses penyambungan RNA (Gambar –
58
21)
Gambar 21 Ringkasan langkah-langkah yang mengarah dari gen ke
protein pada eucaryotes dan bakteri. Tingkat akhir protein dalam sel
tergantung pada efisiensi setiap langkah dan pada tingkat degradasi RNA
dan molekul protein. (A) Dalam sel eukariotik, molekul RNA yang
dihasilkan dari transkripsi mengandung urutan pengkodean (exon) dan
noncoding (intron). Sebelum dapat diterjemahkan menjadi protein,
kedua ujung RNA dimodifikasi, intron dihilangkan oleh reaksi splicing
RNA yang dikatalisis secara enzimatik, dan mRNA yang dihasilkan
diangkut dari inti ke sitoplasma. Meskipun langkah-langkah dalam
gambar ini digambarkan sebagai terjadi satu per satu, secara berurutan,
pada kenyataannya mereka dapat terjadi secara bersamaan. Misalnya,
tutup RNA ditambahkan dan splicing biasanya dimulai sebelum
59
transkripsi selesai. Karena hubungan antara transkripsi dan pemrosesan
RNA, transkrip primer — RNA yang akan, secara teori, diproduksi jika
tidak ada pemrosesan yang terjadi — hanya jarang ditemukan. (B)
Dalam procaryotes, produksi mRNA jauh lebih sederhana. Ujung 5’ dari
molekul mRNA diproduksi oleh inisiasi transkripsi, dan ujung 3’
diproduksi oleh terminasi transkripsi. Karena sel procaryotic tidak
memiliki nukleus, transkripsi dan translasi terjadi di kompartemen
umum. Faktanya, terjemahan mRNA bakteri sering dimulai sebelum
sintesisnya selesai.
Gambar 22 perbandingan struktur molekul mRNA procaryotic dan
eukariotik. (A) Ujung 5’ dan 3’ dari mRNA bakteri yaitu ujung rantai
yang tidak dimodifikasi yang disintesis oleh RNA polimerase, yang
masing-masing menginisiasi dan mengakhiri transkripsi pada titik-titik
tersebut. Ujung yang sesuai dari mRNA eukariotik dibentuk dengan
menambahkan 5’ cap dan dengan pembelahan transkrip pra-mRNA dan
penambahan ekor poli-A, masing-masing. Gambar tersebut juga
menggambarkan perbedaan lain antara mRNA procaryotic dan
60
eukariotik: mRNA bakteri dapat berisi instruksi untuk beberapa protein
yang berbeda, sedangkan mRNA eukariotik hampir selalu berisi
informasi hanya untuk satu protein tunggal. (B) Struktur tutup pada
ujung 5’ dari molekul mRNA eukariotik. Perhatikan keterkaitan 5’-ke-5’
yang tidak biasa dari 7-metil G dengan sisa RNA. Banyak mRNA
eukariotik membawa modifikasi tambahan: kelompok 2-hidroksil pada
gula ribosa kedua dalam mRNA dimetilasi (tidak diperlihatkan).
Kedua ujung mRNA eukariotik dimodifikasi: dengan
membatasi pada ujung 5’ dan dengan polyadenylation dari
ujung 3’ (Gambar 22). Ujung-ujung khusus ini
memungkinkan sel untuk menilai apakah kedua ujung
molekul mRNA hadir (dan karena itu pesannya utuh)
sebelum mengekspor urutan RNA dari nukleus dan
menerjemahkannya menjadi protein. Penyambungan RNA
menggabungkan bagian-bagian berbeda dari urutan
pengkodean protein, dan memberikan kemampuan
eucaryotes yang lebih tinggi dengan kemampuan untuk
mensintesis beberapa protein berbeda dari gen yang sama.
Mekanisme cerdik memasangkan semua langkah
pemrosesan RNA di atas untuk pemanjangan transkripsi.
Seperti dibahas sebelumnya, langkah kunci dalam inisiasi
transkripsi oleh RNA polimerase II yaitu fosforilasi ekor
RNA polimerase II, yang disebut CTD (domain C-terminal).
61
Fosforilasi ini berlangsung secara bertahap saat RNA
polimerase memulai transkripsi dan bergerak di sepanjang
DNA. Ini tidak hanya membantu memisahkan RNA
polimerase II dari protein lain yang ada pada titik awal
transkripsi, namun juga memungkinkan satu set protein baru
untuk dikaitkan dengan ekor RNA polimerase yang
berfungsi dalam pemanjangan transkripsi dan pemrosesan
RNA. Seperti yang dibahas selanjutnya, beberapa protein
pemrosesan ini tampaknya "melompat" dari ekor polimerase
ke molekul RNA yang baru lahir untuk mulai
memprosesnya saat muncul dari RNA polimerase. Dengan
demikian, kita dapat melihat RNA polimerase II dalam
mode perpanjangannya sebagai pabrik RNA yang
mentranskripsi DNA menjadi RNA dan memproses RNA
yang dihasilkannya (Gambar 23). Diperpanjang penuh,
CTD hampir 10 kali lebih lama dari sisa RNA polimerase
dan, pada dasarnya, berfungsi sebagai penambat, menahan
berbagai protein di dekatnya hingga dibutuhkan. Strategi ini,
yang mempercepat laju reaksi selanjutnya, yaitu salah satu
yang biasa diamati dalam sel (lihat Gambar 4-69 dan 16-38).
62
Gambar 23. Eukariotik RNA polimerase II sebagai “pabrik RNA.”
saat polimerase mentranskripsi DNA menjadi RNA, ia membawa
protein pemrosesan-mRNA pada ekornya yang ditransfer ke RNA yang
baru lahir pada waktu yang tepat. Ekor, yang dikenal sebagai CTD,
mengandung 52 ulangan tandem dari urutan tujuh asam amino, dan ada
dua serin di setiap ulangan. Protein capping pertama-tama mengikat ekor
RNA polimerase saat dip memfosforilasi pada Ser5 heptad yang
diulang terlambat dalam proses inisiasi transkripsi (lihat Gambar 16).
Strategi ini memastikan bahwa molekul RNA dibatasi secara efisien
segera setelah ujung 5’ muncul dari RNA polimerase. Sebagai polimerase
terus menyalin, ekornya secara luas terfosforilasi pada posisi Ser2 oleh
63
kinase yang terkait dengan polimerase memanjang dan akhirnya
mengalami defosforilasi pada posisi Ser5. Modifikasi lebih lanjut ini
menarik splicing dan 3’ pemrosesan akhir protein ke polimerase
bergerak, memposisikan mereka untuk bertindak pada RNA yang baru
disintesis saat muncul dari RNA polimerase. Ada banyak enzim
pemrosesan RNA, dan tidak semua berjalan dengan polymerase. Untuk
penyambungan RNA, misalnya, ekor hanya membawa beberapa
komponen penting; sekali ditransfer ke molekul RNA, mereka berfungsi
sebagai situs nukleasi untuk komponen yang tersisa.
saat RNA polimerase II selesai menyalin gen, ia dilepaskan dari
DNA, fosfatase larut menghilangkan fosfat pada ekornya, dan dapat
memulai kembali transkripsi. Hanya bentuk RNA polimerase II
terdefosforilasi yang kompeten untuk memulai sintesis RNA pada
promotor.
RNA Capping yaitu Modifikasi Pertama Pre-mRNA
Eukariotik
Begitu RNA polimerase II telah menghasilkan sekitar
25 nukleotida RNA, ujung 5’ dari molekul RNA baru
dimodifikasi dengan penambahan penutup yang terdiri dari
nukleotida guanin yang dimodifikasi (lihat Gambar 22B).
Tiga enzim, bertindak secara berurutan, melakukan reaksi
pembatasan: satu (fosfat) menghilangkan fosfat dari ujung 5’
RNA yang baru lahir, yang lain (transfer guanyl)
menambahkan GMP dalam hubungan balik (sebagai
gantinya 5’ menjadi 5’ dari 5’ hingga 3’), dan yang ketiga
64
(metil transferase) menambahkan gugus metil ke guanosin
(Gambar 24). Karena ketiga enzim mengikat ekor RNA
polimerase terfosforilasi pada posisi serin-5, modifikasi yang
ditambahkan oleh TFIIH selama inisiasi transkripsi, mereka
siap untuk memodifikasi 5’ ujung transkrip yang baru lahir
segera setelah muncul dari polimerase.
Tutup 5’-metil menandakan ujung 5’ mRNA
eukariotik, dan landmark ini membantu sel untuk
membedakan mRNA dari jenis molekul RNA lain yang ada
dalam sel. Sebagai contoh, RNA polimerase I dan III
menghasilkan RNA yang tidak tertutup selama transkripsi,
sebagian karena polimerase ini tidak memiliki CTD. Dalam
nukleus, tutup mengikat kompleks protein yang disebut CBC
(kompleks pengikat tutup), yang, seperti yang akan kita
bahas di bagian selanjutnya, membantu RNA diproses dan
diekspor dengan benar. Tutup 5’-metil juga memiliki peran
penting dalam penerjemahan mRNA dalam sitosol, seperti
yang akan kita bahas nanti dalam bab ini.
65
Gambar 24. Reaksi yang membatasi ujung 5’ dari
setiap molekul RNA yang disintesis oleh RNA polimerase II. Penutup
akhir berisi tautan baru 5’-ke-5’ antara residu 7-metil G bermuatan positif
dan ujung 5’dari transkrip RNA (lihat Gambar –22B). Huruf N mewakili
salah satu dari empat ribonukleotida, meskipun nukleotida yang
memulai rantai RNA biasanya berupa purin (A atau G). (Setelah A.J.
Shatkin, BioEssays 7: 275-277, 1987. Dengan izin dari ICSU Press.)
66
Penyambungan RNA Menghapus Urutan Intron dari Pra-
mRNA yang Baru Ditranskripsi
Seperti dibahas pada Bab 4, urutan pengkodean protein
dari gen eukariotik biasanya terganggu oleh urutan intervensi
nonkode (intron). Ditemukan pada tahun 1977, fitur gen
eukariotik ini mengejutkan para ilmuwan, yang sampai saat
itu, hanya mengenal gen bakteri, yang biasanya terdiri dari
rangkaian terus menerus pengkodean DNA yang secara
langsung ditranskripsi menjadi mRNA. Dalam kontras yang
ditandai, gen eukariotik ditemukan dipecah menjadi
potongan-potongan kecil dari urutan pengkodean (urutan
yang diekspresikan atau ekson) diselingi dengan urutan
intervensi yang lebih lama atau intron; dengan demikian,
bagian pengkodean gen eukariotik seringkali hanya sebagian
kecil dari panjang gen (Gambar 25).
Gambar 25. Struktur dua gen manusia menunjukkan susunan ekson
dan intron. (A) Gen b-globin yang relatif kecil, yang mengkodekan salah
satu subunit dari protein hemoglobin pembawa oksigen, mengandung 3
67
ekson (lihat juga Gambar 4-7). (B) Gen Faktor VIII yang jauh lebih besar
mengandung 26 ekson; itu kode untuk protein (Faktor VIII) yang
berfungsi dalam jalur pembekuan darah. Bentuk paling umum dari hasil
hemofilia dari mutasi pada gen ini.
Kedua urutan intron dan exon ditranskripsi menjadi
RNA. Urutan intron dihapus dari RNA yang baru disintesis
melalui proses splicing RNA. Sebagian besar penyambungan
RNA yang terjadi dalam fungsi sel dalam produksi mRNA,
dan diskusi kami tentang penyambungan berfokus pada apa
yang disebut penyambungan prekursor-mRNA (atau pra-
mRNA). Hanya setelah 5’ dan 3’ proses akhir dan splicing
telah terjadi yaitu RNA yang disebut mRNA.
Setiap peristiwa penyambungan menghilangkan satu
intron, melanjutkan melalui dua reaksi transfer fosforil
berurutan yang dikenal sebagai transesterifikasi; ini
bergabung dengan dua ekson sambil menghapus intron
sebagai "lariat" (Gambar 26). Karena jumlah ikatan fosfat
berenergi tinggi tetap sama, reaksi ini pada prinsipnya dapat
terjadi tanpa hidrolisis nukleosida trifosfat. Namun, mesin
yang mengkatalisasi penyambungan pra-mRNA rumit,
terdiri dari 5 molekul RNA tambahan dan sebanyak 200
protein, dan itu menghidrolisis banyak molekul ATP per
68
peristiwa penyambungan. Kompleksitas tambahan ini
memastikan bahwa splicing akurat, sementara pada saat
yang sama cukup fleksibel untuk menangani berbagai
macam intron yang ditemukan dalam sel eukariotik yang
khas.
Gambar 26 Reaksi splicing pra-mRNA. (A) Pada langkah pertama,
adenin nukleotida spesifik dalam urutan intron (ditunjukkan dengan
warna merah) menyerang situs splice 5’ dan memotong tulang punggung
sugarphosphate dari RNA pada titik ini. Potongan 5’ ujung intron secara
kovalen terkait dengan adenin nukleotida, seperti yang ditunjukkan
secara rinci dalam (B), sehingga menciptakan loop dalam molekul RNA.
69
Ujung bebas 3’ -OH yang dirilis bebas dari urutan ekson kemudian
bereaksi dengan dimulainya urutan ekson berikutnya, menggabungkan
kedua ekson bersama-sama dan melepaskan urutan intron dalam bentuk
lariat. Dengan demikian, dua sekuens ekson bergabung menjadi sekuens
pengkodean yang berkelanjutan; urutan intron yang dirilis akhirnya
terdegradasi
Tampaknya boros untuk menghapus intron dalam
jumlah besar dengan penyambungan RNA. Dalam upaya
menjelaskan mengapa itu terjadi, para ilmuwan telah
menunjukkan bahwa pengaturan ekson-intron tampaknya
akan memfasilitasi kemunculan protein baru dan bermanfaat
dalam skala waktu evolusi. Dengan demikian, keberadaan
banyak intron dalam DNA memungkinkan rekombinasi
genetik dengan mudah menggabungkan ekson dari gen yang
berbeda (lihat hal. 140), memungkinkan gen untuk protein
baru berkembang lebih mudah dengan kombinasi bagian-
bagian gen yang sudah ada sebelumnya. Pengamatan,
dijelaskan dalam Bab 3, bahwa banyak protein dalam sel
saat ini menyerupai tambal sulam yang terdiri dari satu set
domain protein yang umum, mendukung gagasan ini.
Penyambungan RNA juga memiliki keunggulan saat
ini. Transkrip dari banyak gen eukariotik (diperkirakan 75%
dari gen pada manusia) disambung dalam lebih dari satu
70
cara, sehingga memungkinkan gen yang sama untuk
menghasilkan serangkaian protein berbeda yang sesuai
(Gambar 27). dibandingkan menjadi proses yang sia-sia seperti
yang terlihat pada pandangan pertama, splicing RNA
memungkinkan eucaryotes untuk meningkatkan potensi
pengkodean genom mereka yang sudah sangat besar. Kita
akan kembali ke ide ini lagi dalam bab ini dan selanjutnya,
namun pertama-tama kita perlu menggambarkan mesin seluler
yang melakukan tugas luar biasa ini.
Gambar 27 Penyambungan alternatif dari gen α-tropomyosin dari
tikus. α-Tropomyosin yaitu protein koil-koil (lihat Gambar 3–9) yang
mengatur kontraksi dalam sel otot. Transkrip primer dapat disambung
dengan cara yang berbeda, seperti yang ditunjukkan pada gambar, untuk
menghasilkan mRNA yang berbeda, yang kemudian memunculkan
protein varian. Beberapa pola splicing spesifik untuk tipe sel tertentu.
Sebagai contoh, α-tropomyosin yang dibuat dalam otot lurik berbeda dari
71
yang dibuat dari gen yang sama pada otot polos. Panah di bagian atas
gambar menandai situs tempat pembelahan dan penambahan poli-A
membentuk 3’ ujung mRNA dewasa
Sinyal Urutan Nukleotida Dimana Penyambungan Terjadi
Mekanisme splicing pra-mRNA yang ditunjukkan pada
Gambar 26 menyiratkan bahwa mesin splicing harus
mengenali tiga bagian dari molekul RNA prekursor: situs
splice 5’, situs splice 3’, dan titik cabang dalam urutan intron
yang membentuk dasar lariat yang dipotong. Tidak
mengherankan, setiap situs memiliki urutan konsensus
nukleotida yang mirip dari intron ke intron dan memberikan
sel dengan isyarat untuk tempat splicing akan terjadi
(Gambar –28). Namun, urutan konsensus ini relatif singkat
dan dapat mengakomodasi tingkat variabilitas urutan yang
tinggi; seperti yang akan kita lihat sebentar lagi, sel
memasukkan jenis informasi tambahan untuk akhirnya
memilih di mana, pada setiap molekul RNA, penyambungan
akan terjadi.
72
Gambar 28 Urutan nukleotida konsensus dalam molekul RNA yang
menandakan awal dan akhir sebagian besar intron pada manusia.
Hanya tiga blok sekuens nukleotida yang diperlihatkan yang diperlukan
untuk menghilangkan sekuens intron; sisa intron dapat ditempati oleh
nukleotida apa pun. Di sini A, G, U, dan C yaitu nukleotida RNA
standar; R yaitu purin (A atau G); dan Y berarti pirimidin (C atau U).
Huruf A yang disorot dengan warna merah merupakan titik cabang dari
lariat yang dihasilkan oleh splicing. Hanya GU pada awal intron dan AG
pada akhirnya yaitu nukleotida invarian dalam urutan konsensus
penyambungan. Beberapa nukleotida yang berbeda dapat menempati
posisi yang tersisa (bahkan titik cabang A), walaupun nukleotida yang
ditunjukkan lebih disukai. Jarak di sepanjang RNA antara tiga urutan
konsensus penyambungan sangat bervariasi; Namun, jarak antara titik
cabang dan 3’ sambungan sambatan biasanya jauh lebih pendek dibandingkan
jarak antara 5’ sambungan sambatan dan titik cabang.
73
Variabilitas tinggi dari urutan konsensus
penyambungan menyajikan tantangan khusus bagi para
ilmuwan yang mencoba menguraikan urutan genom. Intron
berkisar dalam ukuran dari sekitar 10 nukleotida hingga
lebih dari 100.000 nukleotida, dan memilih batas yang tepat
dari setiap intron yaitu tugas yang sulit bahkan dengan
bantuan komputer yang kuat. Kemungkinan splicing
alternatif mempersulit masalah memprediksi sekuens protein
hanya dari sekuens genom. Kesulitan ini yaitu salah satu
hambatan utama untuk mengidentifikasi semua gen dalam
urutan genom lengkap, dan itu yaitu salah satu alasan
utama mengapa kita hanya tahu perkiraan jumlah gen dalam
genom manusia.
Penyambungan RNA Dilakukan oleh Spliceosome
Tidak seperti langkah-langkah lain dari produksi
mRNA yang telah kita bahas, langkah-langkah kunci dalam
penyambungan RNA dilakukan oleh molekul RNA dibandingkan
protein. Molekul RNA khusus mengenali sekuens nukleotida
yang menentukan di mana splicing akan terjadi dan juga
74
berpartisipasi dalam kimia splicing. Molekul RNA ini relatif
pendek (masing-masing kurang dari 200 nukleotida), dan ada
lima di antaranya (U1, U2, U4, U5, dan U6) yang terlibat
dalam bentuk utama penyambungan pra-mRNA. Dikenal
sebagai snRNAs (small RNA nuklir), masing-masing
dikomplekskan dengan setidaknya tujuh subunit protein
untuk membentuk snRNP (ribonucleoprotein nuklir kecil).
SnRNPs ini membentuk inti dari spliceosome, kumpulan
besar molekul RNA dan protein yang melakukan splicing
pra-mRNA dalam sel.
Spliceosome yaitu mesin yang kompleks dan dinamis.
saat dipelajari secara in vitro, beberapa komponen
spliceosome berkumpul pada pre-mRNA dan, saat reaksi
splicing berlangsung, komponen-komponen baru masuk
saat komponen-komponen yang sudah melakukan tugas-
tugasnya dibuang (Gambar 29). Namun, banyak ilmuwan
percaya bahwa, di dalam sel, spliceosome yaitu perakitan
longgar semua komponen yang sudah ada sebelumnya,
menangkap, menyambungkan dan melepaskan RNA sebagai
unit terkoordinasi, dan menjalani penataan ulang yang luas
setiap kali sambatan dibuat. Selama reaksi penyambungan,
75
pengenalan sambungan splice 5’, situs titik cabang, dan
sambungan splice 3’ dilakukan sebagian besar melalui pair-
pairing antara snRNAs dan urutan konsensus RNA dalam
substrat pra-mRNA (Gambar 30). Dalam proses splicing,
spliceosome mengalami beberapa perubahan di mana satu
set interaksi basa-pasangan rusak dan yang lain terbentuk di
tempatnya. Misalnya, U1 digantikan oleh U6 di
persimpangan splice 5’ (lihat Gambar 30A). Jenis penataan
ulang RNA-RNA (di mana pembentukan satu interaksi
RNA-RNA membutuhkan gangguan yang lain) terjadi
beberapa kali selama reaksi splicing. Ini memungkinkan
pemeriksaan dan pengecekan ulang urutan RNA sebelum
reaksi kimia diizinkan untuk melanjutkan, sehingga
meningkatkan akurasi penyambungan.
76
Gambar 29 Mekanisme penyambungan pra-mRNA. Penyambungan
RNA dikatalisis oleh rakitan snRNPs (ditampilkan sebagai lingkaran
berwarna) ditambah protein lain (kebanyakan tidak ditampilkan), yang
bersama-sama membentuk spliceosome. Spliceosome mengenali sinyal
77
penyambungan pada molekul pra-mRNA, menyatukan kedua ujung
intron, dan menyediakan aktivitas enzimatik untuk dua langkah reaksi
(lihat Gambar 26).
Gambar 30 Beberapa penataan ulang yang terjadi di spliceosome
selama splicing pra-mRNA. Berikut ini yaitu rincian untuk ragi
Saccharomyces cerevisiae, di mana urutan nukleotida yang terlibat
sedikit berbeda dari yang ada di sel manusia. (A) Pertukaran U1 snRNP
untuk U6 snRNP terjadi sebelum reaksi transfer fosforil pertama (lihat
Gambar –29). Pertukaran ini membutuhkan situs splice 5’ untuk dibaca
oleh dua snRNP yang berbeda, sehingga meningkatkan akurasi
pemilihan situs splice 5’ oleh spliceosome. (B) Situs titik cabang pertama
kali diakui oleh BBP dan selanjutnya oleh U2 snRNP; seperti pada (A),
strategi "periksa dan periksa kembali" ini memberikan peningkatan
akurasi pemilihan lokasi. Pengikatan U2 ke titik cabang memaksa
78
adenine yang sesuai (berwarna merah) tidak berpasangan dan dengan
demikian mengaktifkannya untuk serangan pada situs splice 5’ (lihat
Gambar –29). Ini, dalam kombinasi dengan pengakuan oleh BBP, yaitu
cara di mana spliceosome secara akurat memilih adenin yang pada
akhirnya membentuk titik cabang. (C) Setelah reaksi transfer fosforil
pertama (kiri) terjadi, serangkaian pengaturan ulang membawa kedua
ekson menjadi dekat untuk reaksi transfer fosforil kedua (kanan). SnRNA
keduanya memposisikan reaktan dan memberikan (baik semua atau
sebagian) situs katalitik untuk dua reaksi. SnRNP U5 hadir dalam
spliceosome sebelum penataan ulang ini terjadi; untuk kejelasannya telah
dihilangkan dari panel kiri. Seperti yang dibahas dalam teks, semua
penataan ulang RNA-RNA yang ditunjukkan pada gambar ini (serta
yang lain yang terjadi pada spliceosome namun tidak ditampilkan)
memerlukan partisipasi protein tambahan dan hidrolisis ATP.
Spliceosome Menggunakan Hidrolisis ATP untuk
Menghasilkan Serangkaian Penataan RNA-RNA
Kompleks
Meskipun hidrolisis ATP tidak diperlukan untuk kimia
splicing RNA per se, itu diperlukan untuk perakitan dan
penataan ulang spliceosome. Beberapa protein tambahan
yang membentuk spliceosome menggunakan energi
hidrolisis ATP untuk memutus interaksi RNA-RNA yang
ada untuk memungkinkan pembentukan yang baru.
Faktanya, semua langkah yang ditunjukkan sebelumnya
pada Gambar 29 kecuali hubungan BBP dengan situs titik
79
cabang dan U1 snRNP dengan situs splice 5’ membutuhkan
hidrolisis ATP dan protein tambahan. Setiap sambatan yang
berhasil membutuhkan sebanyak 200 protein, jika kita
termasuk yang membentuk snRNP.
Penataan ulang RNA-RNA yang membutuhkan ATP
yang terjadi di spliceosome terjadi di dalam snRNPs sendiri
dan antara snRNPs dan substrat premRNA. Salah satu
fungsi terpenting dari penyusunan ulang ini yaitu
pembuatan situs katalitik aktif spliceosome. Strategi
membuat situs aktif hanya setelah perakitan dan penataan
ulang komponen penyambungan pada substrat pra-mRNA
yaitu cara yang sangat efektif untuk mencegah cara
penyambungan ruang.
Mungkin fitur yang paling mengejutkan dari
spliceosome yaitu sifat situs katalitik itu sendiri: sebagian
besar (jika tidak secara eksklusif) dibentuk oleh molekul
RNA bukan protein. Pada bagian terakhir bab ini kita
membahas secara umum sifat struktural dan kimia dari RNA
yang memungkinkannya untuk melakukan katalisis; di sini
kita hanya perlu mempertimbangkan bahwa snRNA U2 dan
U6 dalam spliceosome membentuk struktur RNA tiga
80
dimensi yang tepat yang menyandingkan situs splice 5’ dari
pre-mRNA dengan situs titik-cabang dan mungkin
melakukan reaksi transesterifikasi pertama (lihat Gambar
30C). Dengan cara yang sama, sambungan sambatan 5’ dan
3’ disatukan (suatu peristiwa yang membutuhkan snRNA
U5) untuk memfasilitasi transesterifikasi kedua.
Setelah kimia penyambungan selesai, snRNP tetap
terikat pada lariat. Pembongkaran snRNP ini dari lariat (dan
dari satu sama lain) membutuhkan serangkaian penataan
ulang RNA-RNA yang membutuhkan hidrolisis ATP,
sehingga mengembalikan snRNA ke konfigurasi aslinya
sehingga dapat dipakai kembali dalam reaksi baru. Pada
penyelesaian splice, spliceosome mengarahkan satu set
protein untuk berikatan dengan mRNA di dekat posisi yang
sebelumnya ditempati oleh intron. Disebut sebagai exon
junction complex (EJC), protein-protein ini menandai lokasi
peristiwa penyambungan yang berhasil dan, seperti yang
akan kita lihat nanti dalam bab ini, memengaruhi nasib
mRNA selanjutnya.
81
Properti Lain dari Pre-mRNA dan Sintesisnya Membantu
Menjelaskan Pilihan Situs Sambungan yang Tepat
Seperti yang telah kita lihat, urutan intron sangat
bervariasi dalam ukuran, dengan beberapa yang melebihi
100.000 nukleotida. Jika pemilihan tempat-splice ditentukan
semata-mata oleh snRNP yang bekerja pada molekul RNA
yang dibentuk sebelumnya dan bebas protein, kita akan
mengharapkan kesalahan penyambungan seperti lompatan
ekson dan penggunaan situs splice “samar” menjadi sangat
umum (Gambar 31). Mekanisme kesetiaan dibangun ke
dalam spliceosome, bagaimanapun, dilengkapi oleh dua
strategi tambahan yang meningkatkan akurasi splicing. Yang
pertama hanyalah konsekuensi dari tahap awal splicing yang
terjadi sementara molekul pra-mRNA sedang disintesis oleh
RNA polimerase II. Sebagai hasil transkripsi, ekor
terfosforilasi dari RNA polimerase membawa beberapa
komponen spliceosome (lihat Gambar 23), dan komponen-
komponen ini ditransfer langsung dari polimerase ke RNA
saat RNA disintesis. Strategi ini membantu sel melacak
intron dan ekson: misalnya, snRNP yang berkumpul di situs
splice 5’ awalnya disajikan dengan hanya situs splice 3’
82
tunggal karena situs lebih jauh hilir belum disintesis.
Koordinasi transkripsi dengan splicing sangat penting dalam
mencegah skipping ekson yang tidak pantas.
Gambar 31 Dua jenis kesalahan penyambungan. (A) Exon melewatkan.
(B) Pemilihan lokasi sambaran samar. (B) Pemilihan lokasi sambaran
samar. Sinyal splicing cryptic yaitu urutan nukleotida RNA yang
sangat mirip dengan sinyal splicing sejati.
Strategi yang disebut "definisi exon" yaitu cara lain
sel memilih situs sambungan yang tepat. Ukuran ekson
cenderung jauh lebih seragam dibandingkan ukuran intron, rata-
rata sekitar 150 pasangan nukleotida di berbagai organisme
eukariotik (Gambar 32). Menurut ide definisi ekson, mesin
splicing awalnya mencari urutan ekson berukuran relatif
83
homogen. Sebagai hasil sintesis RNA, sekelompok
komponen tambahan (terutama protein SR, dinamai karena
mengandung domain yang kaya akan serin dan arginin)
berkumpul pada urutan ekson dan membantu menandai
setiap situs splice 3’ dan 5’ mulai dari 5’ akhir RNA
(Gambar 33). Protein-protein ini, pada gilirannya, merekrut
U1 snRNA, yang menandai batas ekson hilir, dan U2AF,
yang menentukan yang hulu. Dengan secara khusus
menandai ekson dengan cara ini dan dengan demikian
mengambil keuntungan dari ukuran ekson yang relatif
seragam, sel meningkatkan keakuratan dengan mana ia
menyimpan komponen penyambungan awal pada RNA
yang baru lahir dan dengan demikian membantu untuk
menghindari tempat sambungan yang samar. Bagaimana
protein SR membedakan urutan ekson dari urutan intron
tidak dipahami secara rinci; Namun, diketahui bahwa
beberapa protein SR berikatan secara istimewa dengan
sekuens RNA spesifik dalam ekson, disebut peningkat
penyambungan. Pada prinsipnya, karena salah satu dari
beberapa kodon yang berbeda dapat dipakai untuk
mengkode asam amino yang diberikan, ada kebebasan untuk
menyesuaikan urutan nukleotida ekson sehingga dapat
84
membentuk situs pengikatan untuk protein SR, tanpa harus
mempengaruhi urutan asam amino yang exon menentukan.
Gambar 32 Variasi dalam panjang intron dan exon pada genom
manusia, cacing, dan lalat. (A) Ukuran distribusi ekson. (B) Ukuran
distribusi intron. Perhatikan bahwa panjang ekson jauh lebih seragam
dibandingkan panjang intron. (Diadaptasi dari International Human Genome
Sequencing Consortium, Nature 409: 860–921, 2001. Dengan izin dari
Macmillan Publishers Ltd.)
Penandaan batas ekson dan intron dan perakitan
spliceosome dimulai pada molekul RNA sementara itu
masih memanjang oleh RNA polimerase pada ujung 3’ nya.
Namun, kimia splicing yang sebenarnya dapat terjadi jauh di
kemudian hari. Penundaan ini berarti bahwa urutan intron
tidak harus dihilangkan dari molekul pra-mRNA dalam
85
urutan di mana mereka terjadi di sepanjang rantai RNA. Ini
juga berarti bahwa, meskipun perakitan spliceosome yaitu
co-transkripsional, reaksi splicing kadang-kadang terjadi
pasca transkripsi yaitu, setelah molekul pra-mRNA lengkap
dibuat. Namun, kimia splicing yang sebenarnya dapat terjadi
jauh di kemudian hari. Penundaan ini berarti bahwa urutan
intron tidak harus dihilangkan dari molekul pra-mRNA
dalam urutan di mana mereka terjadi di sepanjang rantai
RNA. Ini juga berarti bahwa, meskipun perakitan
spliceosome yaitu co-transkripsional, reaksi splicing
kadang-kadang terjadi pasca transkripsi - yaitu, setelah
molekul pra-mRNA lengkap dibuat.
86
Gambar 33. Gagasan definisi ekson. Menurut satu proposal, protein SR
mengikat setiap urutan ekson dalam premRNA dan dengan demikian
membantu memandu snRNPs ke batas intron / ekson yang tepat.
Demarkasi ekson oleh protein SR ini terjadi secara co-transkripsi,
dimulai dari CBC (kompleks pengikat) di ujung 5 ‘. Seperti ditunjukkan,
urutan intron dalam pre-mRNA, yang bisa sangat panjang, dikemas ke
dalam kompleks hnRNP (ribonucleoprotein nuklir heterogen) yang
memadatkannya menjadi struktur yang lebih mudah dikelola dan
mungkin menutupi situs splice cryptic. Telah diusulkan bahwa protein
hnRNP dapat secara istimewa berasosiasi dengan urutan intron dan
bahwa preferensi ini juga dapat membantu spliceosome membedakan
intron dari ekson. Namun, seperti yang ditunjukkan, setidaknya beberapa
protein hnRNP juga mengikat urutan ekson. (Diadaptasi dari R. Reed,
Curr. Opin. Cell Biol. 12: 340–345, 2000. Dengan izin dari Elsevier.)
87
Seperangkat kedua snRNPs Menyambung Sebagian Kecil
dari Urutan Intron pada Hewan dan Tumbuhan
Eucaryotes sederhana seperti ragi hanya memiliki satu
set snRNP yang melakukan semua penyambungan pra-
mRNA. Namun, eukariota yang lebih kompleks seperti lalat,
mamalia, dan tumbuhan memiliki set kedua snRNP yang
mengarahkan penyambungan sebagian kecil dari urutan
intronnya. Bentuk minor spliceosome ini mengenali
rangkaian sekuens RNA yang berbeda pada persimpangan
splice 5’ dan 3’ dan pada titik cabang; itu disebut
spliceosome tipe U12 karena keterlibatan SnRNP U12
(Gambar 34A). Meskipun mengenali urutan nukleotida yang
berbeda, snRNPs dalam spliceosome ini membuat jenis
interaksi RNA-RNA yang sama dengan pre-mRNA dan
dengan satu sama lain seperti halnya snRNP utama (Gambar
–34B). Meskipun, seperti yang telah kita lihat, komponen-
komponen spliceosom utama berjalan dengan RNA
polimerase II saat mentranskripsikan gen, ini mungkin
bukan kasus untuk spliceosome U12. Mungkin saja splicing
yang dimediasi-U12 dengan demikian tertunda, dan ini
menghadirkan sel dengan cara untuk mengatur co-splicing
88
beberapa ratus gen yang ekspresinya membutuhkan
spliceosome ini. Sejumlah mRNA mamalia mengandung
campuran intron, beberapa dihilangkan oleh spliceosome
utama dan lainnya oleh spliceosome minor, dan telah
diusulkan bahwa pengaturan ini memungkinkan pola rumit
khusus dari splicing alternatif terjadi.
Beberapa organisme eukariotik menunjukkan variasi
tertentu pada splicing, yang disebut trans-splicing.
Organisme ini termasuk trypanosoma sel tunggal protozoa
yang menyebabkan penyakit tidur pada manusia di Afrika
dan model organisme multiseluler, cacing nematode. Dalam
trans-splicing, ekson dari dua transkrip RNA terpisah
disambungkan bersama untuk membentuk molekul mRNA
yang matang (lihat Gambar 34A). Trypanosom
memproduksi semua mRNA mereka dengan cara ini,
sedangkan trans-splicing hanya menyumbang sekitar 1% dari
nematoda mRNA. Dalam kedua kasus, ekson tunggal
disambungkan ke ujung 5’ dari banyak transkrip RNA
berbeda yang diproduksi oleh sel; dengan cara ini, semua
produk trans-splicing memiliki ekson 5’ yang sama dan
ekson 3’ yang berbeda. Banyak snRNP yang sama yang
89
berfungsi dalam splicing konvensional dipakai dalam
reaksi ini, meskipun transsplicing menggunakan snRNP unik
(disebut SL RNP) yang membawa ekson umum (lihat
Gambar 34).
Gambar 34 Garis mekanisme yang dipakai untuk tiga jenis
penyambungan RNA. (A) Tiga jenis spliceosom. Spliceosome utama
(kiri), spliceosome tipe U12 (tengah), dan trans-spliceosome (kanan)
masing-masing ditampilkan pada dua tahap perakitan. Intron yang
dihilangkan oleh spliceosome tipe U12 memiliki serangkaian sekuens
nukleotida konsensus yang berbeda dari yang dihilangkan oleh
spliceosome utama. Pada manusia, diperkirakan 0,1% intron dihilangkan
90
oleh spliceosome tipe U12. Dalam trans-splicing, yang tidak terjadi pada
manusia, SL snRNP dikonsumsi dalam reaksi karena sebagian dari SL
snRNA menjadi ekson pertama dari mRNA dewasa. (B) UR snRNP
utama dan UR snRNP khusus untuk spliceosome tipe U12 keduanya
mengenali sambungan splice 5’, namun mereka melakukannya melalui
interaksi pasangan pasangan basa yang berbeda. Urutan yang
ditampilkan yaitu dari manusia. (Diadaptasi dari Y.T. Yu et al., The
RNA World, hlm. 487-524. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1999.)
Kita tidak tahu mengapa beberapa organisme
menggunakan trans-splicing; Namun, diperkirakan bahwa
ekson 5’ umum dapat membantu dalam menerjemahkan
mRNA. Dengan demikian, mRNA yang dihasilkan oleh
trans-splicing pada nematoda tampaknya diterjemahkan
dengan efisiensi yang sangat tinggi.
Splicing RNA Menunjukkan Plastisitas Luar Biasa
Kita telah melihat bahwa pilihan lokasi sambungan
tergantung pada fitur transkrip premRNA seperti afinitas
dari tiga sinyal pada RNA (persimpangan splice 5’ dan 3’
dan titik cabang) untuk mesin penyambungan, ko-transkripsi
perakitan spliceosome, dan "pembukuan" yang mendasari
definisi ekson. Kita tidak tahu seberapa akurat
penyambungan yang normal karena, seperti yang kita lihat
91
nanti, ada beberapa sistem kendali mutu yang dengan cepat
menghancurkan mRNA yang penyambungannya serba
salah. Namun, kita tahu bahwa, dibandingkan dengan
langkah-langkah lain dalam ekspresi gen, splicing sangat
fleksibel. Sebagai contoh, mutasi dalam urutan nukleotida
penting untuk penyambungan intron tertentu tidak serta
merta mencegah penyambungan intron itu sama sekali.
Sebaliknya, mutasi biasanya menciptakan pola splicing baru
(Gambar 35). Paling umum, ekson hanya dilewati (Gambar
35B). Dalam kasus lain, mutasi menyebabkan sambungan
splice cryptic dipakai secara efisien (Gambar 35C).
Rupanya, mesin splicing telah berevolusi untuk memilih pola
sambungan sambungan terbaik, dan jika yang optimal rusak
oleh mutasi, ia akan mencari pola terbaik berikutnya, dan
seterusnya. Fleksibilitas dalam proses splicing RNA ini
menunjukkan bahwa perubahan pola splicing yang
disebabkan oleh mutasi acak telah menjadi jalur penting
dalam evolusi gen dan organisme.
Plastisitas penyambungan RNA juga berarti bahwa sel
dapat mengatur pola penyambungan RNA. Sebelumnya di
bagian ini kita melihat bahwa splicing alternatif dapat
92
menimbulkan protein berbeda dari gen yang sama. Beberapa
contoh splicing alternatif bersifat konstitutif; yaitu, mRNA
yang disambung secara alternatif diproduksi terus menerus
oleh sel-sel suatu organisme. Namun, dalam banyak kasus,
sel mengatur pola splicing sehingga berbagai bentuk protein
diproduksi pada waktu yang berbeda dan di jaringan yang
berbeda (lihat Gambar 27). Dalam Bab 7 kita kembali ke
masalah ini untuk mendiskusikan beberapa contoh spesifik
dari penyambungan RNA yang diatur.
Gambar 35 pengolahan normal
transkrip RNA primer β-globin pada
manusia dengan penyakit β
thalassemia. Dalam contoh yang
ditunjukkan, penyakit ini disebabkan
oleh mutasi situs splice (panah hitam)
yang ditemukan dalam genom pasien
yang terkena. Kotak biru gelap mewakili
tiga urutan ekson normal; garis merah
menunjukkan situs sambatan 5’ dan 3’.
Kotak biru muda menggambarkan
urutan nukleotida baru yang termasuk
dalam molekul mRNA akhir sebagai
hasil mutasi. Perhatikan bahwa saat
mutasi meninggalkan situs sambatan
normal tanpa pasangan, ekson dilewati
atau satu atau lebih situs splice cryptic
abnormal di dekatnya dipakai sebagai
situs mitra, seperti dalam (C) dan (D).
(Diadaptasi sebagian dari S.H. Orkin,
dalam The Molecular Basis of Blood
Diseases [G. Stamatoyannopoulos et al.,
Eds.], Hlm. 106–126. Philadelphia:
Saunders, 1987.)
93
Penyambungan RNA Spliceosome Catalyzed Mungkin
Berevolusi dari Mekanisme Penyambungan Sendiri
saat spliceosome pertama kali ditemukan, ia
membingungkan para ahli biologi molekuler. Mengapa
molekul RNA bukannya protein melakukan peran penting
dalam pengenalan lokasi splice dan dalam kimia splicing?
Mengapa perantara lariat dipakai dibandingkan alternatif yang
tampaknya lebih sederhana untuk menyatukan 5’ dan 3’
situs sambatan dalam satu langkah, diikuti oleh pembelahan
langsung dan bergabung kembali? Jawaban atas pertanyaan-
pertanyaan ini mencerminkan cara di mana spliceosome
diyakini telah berevolusi.
Sebagaimana dibahas secara singkat di Bab 1 (dan lebih
terinci di bagian akhir bab ini), ada kemungkinan bahwa sel-
sel awal menggunakan molekul RNA dibandingkan protein
sebagai katalis utama mereka dan bahwa mereka
menyimpan informasi genetik mereka dalam RNA dibandingkan
dalam urutan DNA. Reaksi splicing yang dikatalisis oleh
RNA mungkin memiliki peran penting dalam sel-sel awal
ini. Sebagai bukti, beberapa intron penyambungan diri RNA
(yaitu, urutan intron dalam RNA yang penyambungannya
94
dapat terjadi tanpa adanya protein atau molekul RNA
lainnya) tetap ada sampai sekarang misalnya, dalam gen
rRNA nuklir dari Tetrahymena ciliate, di beberapa gen T4
bakteriofag, dan pada beberapa gen mitokondria dan
kloroplas.
Urutan intron penyambungan diri dapat diidentifikasi
dalam tabung reaksi dengan menginkubasi molekul RNA
murni yang berisi urutan intron dan mengamati reaksi
penyambungan. Dua kelas utama dari urutan intron self-
splicing dapat dibedakan dengan cara ini. Grup I urutan intron
mulai reaksi splicing dengan mengikat nukleotida G ke
urutan intron; G ini dengan demikian diaktifkan untuk
membentuk kelompok penyerang yang akan mematahkan
ikatan fosfodiester pertama yang dibelah selama
penyambungan (ikatan di situs splice 5’). Dalam sekuens
intron grup II, residu A yang sangat reaktif dalam sekuens
intron yaitu grup penyerang, dan intermediat lariat
dihasilkan. Kalau tidak, jalur reaksi untuk kedua jenis urutan
intron penyambungan sendiri yaitu sama. Keduanya
dianggap mewakili sisa-sisa mekanisme yang sangat kuno
(Gambar 36).
95
Untuk kedua jenis reaksi splicing sendiri, urutan
nukleotida intron sangat penting; RNA intron terlipat ke
dalam struktur tiga dimensi tertentu, yang menyatukan
persimpangan 5’ dan 3’ bersama-sama dan menyediakan
kelompok reaktif yang diposisikan secara tepat untuk
melakukan kimia (lihat Gambar 6C). Karena kimia reaksi
splicing mereka sangat mirip, telah diusulkan bahwa
mekanisme splicing pra-mRNA dari spliceosome berevolusi
dari kelompok II penyambungan diri. Menurut gagasan ini,
saat snRNPs spliceosomal mengambil alih peran struktural
dan kimia intron kelompok II, batasan sekuens ketat pada
sekuens intron akan menghilang, sehingga memungkinkan
ekspansi besar-besaran dalam jumlah RNA berbeda yang
dapat disambungkan.
96
Gambar 36. Dua kelas sekuens intron penyambungan diri yang
diketahui. Gambar tersebut menekankan kesamaan antara dua
mekanisme. Keduanya biasanya dibantu oleh protein dalam sel yang
mempercepat reaksi, namun katalisis tetap dimediasi oleh RNA dalam
urutan intron. Sekuens intron grup I mengikat nukleotida G bebas ke
situs spesifik pada RNA untuk memulai penyambungan, sedangkan
sekuens intron grup II menggunakan nukleotida A yang reaktif dalam
sekuens intron itu sendiri untuk tujuan yang sama. Kedua jenis reaksi
penyimpanan sendiri membutuhkan intron untuk dilipat menjadi struktur
97
tiga dimensi yang sangat spesifik yang menyediakan aktivitas katalitik
untuk reaksi (lihat Gambar –6). Mekanisme yang dipakai oleh urutan
intron grup II melepaskan intron sebagai struktur lariat dan sangat mirip
dengan jalur splicing pra-mRNA yang dikatalisis oleh spliceosome
(bandingkan dengan Gambar 29). Spliceosome melakukan sebagian
besar penyambungan RNA dalam sel eukariotik, dan RNA
penyambungan sendiri merupakan kasus yang tidak biasa. (Diadaptasi
dari T.R. Cech, Cell 44: 207–210, 1986. Dengan izin dari Elsevier.)
Enzim Pemrosesan RNA Menghasilkan Ujung 3’ dari
mRNA eukariotik
Seperti yang dijelaskan sebelumnya, ujung 5’ dari pre-
mRNA yang diproduksi oleh RNA polimerase II ditutup
segera setelah muncul dari RNA polimerase. Kemudian,
saat polimerase melanjutkan pergerakannya sepanjang
gen, spliceosome berkumpul pada RNA dan
menggambarkan batas intron dan ekson. Ekor terminal C
yang panjang dari RNA polimerase mengoordinasikan
proses-proses ini dengan mentransfer capping dan
menyambungkan komponen secara langsung ke RNA saat
ia muncul dari enzim. Kita melihat di bagian ini bahwa,
saat RNA polimerase II mencapai ujung gen, mekanisme
serupa memastikan bahwa ujung 3’ dari pre-mRNA diproses
dengan tepat.
98
Seperti yang mungkin diharapkan, posisi ujung 3’ dari
setiap molekul mRNA pada akhirnya ditentukan oleh sinyal
yang dikodekan dalam genom (Gambar 37). Sinyal-sinyal ini
ditranskripsi menjadi RNA saat RNA polimerase II
bergerak melaluinya, dan kemudian dikenali (sebagai RNA)
oleh serangkaian protein pengikat RNA dan enzim pemroses
RNA (Gambar 38). Dua protein multisubunit, yang disebut
CstF (faktor stimulasi pembelahan) dan CPSF (faktor
spesifisitas pembelahan dan poligadenilasi), sangat penting.
Kedua protein ini berjalan dengan ekor RNA polimerase dan
ditransfer ke urutan pemrosesan akhir 3’ pada molekul RNA
saat muncul dari RNA polimerase.
Setelah CstF dan CPSF mengikat urutan nukleotida
spesifik pada molekul RNA yang muncul, protein tambahan
berkumpul dengan mereka untuk menciptakan ujung 3’
mRNA. Pertama, RNA dibelah (lihat Gambar –38).
Selanjutnya enzim yang disebut poly-A polimerase (PAP)
menambahkan, satu per satu, sekitar 200 nukleotida ke ujung
3’ yang dihasilkan oleh pembelahan. Prekursor nukleotida
untuk penambahan ini yaitu ATP, dan tipe ikatan 5’-3’
yang sama terbentuk seperti pada sintesis RNA konvensional
99
(lihat Gambar –4). Berbeda dengan RNA polimerase biasa,
poli-A polimerase tidak memerlukan contoh; karenanya,
ekor poli-A mRNA eukariotik tidak secara langsung
dikodekan dalam genom. saat ekor poli-A di sintesis,
protein yang disebut protein pengikat poli-A berkumpul di
atasnya dan, dengan mekanisme yang kurang dipahami,
menentukan panjang akhir ekor. Beberapa protein pengikat
poli-A tetap terikat pada ekor poli-A saat mRNA bergerak
dari nukleus ke sitosol dan mereka membantu mengarahkan
sintesis protein pada ribosom, seperti yang akan kita lihat
nanti dalam bab ini.
Setelah 3’ akhir molekul pre-mRNA eukariotik telah
dibelah, RNA polimerase II terus menyalin, dalam beberapa
kasus untuk ratusan nukleotida. namun polimerase segera
melepaskan cengkeramannya pada contoh dan transkripsi
berakhir. Setelah pembelahan akhir 3’ terjadi, RNA yang
baru disintesis yang muncul dari polimerase tidak memiliki
tutup 5’; RNA yang tidak dilindungi ini dengan cepat
terdegradasi oleh eksonuklease 5’ → 3’ yang dibawa bersama
pada ekor polimerase. Rupanya, degradasi RNA inilah yang
akhirnya menyebabkan RNA polimerase terlepas dari DNA
100
Gambar 37 Urutan nukleotida konsensus yang mengarahkan
pembelahan dan polyadenylation untuk membentuk ujung 3’
dari mRNA eukaryotic. Urutan ini dikodekan dalam genom;
protein spesifik mengenalinya setelah ditranskripsi menjadi RNA.
Hexamer AAUAAA diikat oleh CPSF, elemen kaya GU di luar
situs pembelahan diikat oleh CstF (lihat Gambar 38), dan urutan
CA terikat oleh faktor ketiga yang diperlukan untuk langkah
pembelahan. Seperti sekuens nukleotida konsensus lain yang
dibahas dalam bab ini (lihat Gambar 12), urutan yang ditunjukkan
pada gambar mewakili berbagai pembelahan individu dan sinyal
polyadenylation
101
Gambar 38. Beberapa langkah utama dalam menghasilkan ujung 3’
mRNA eukariotik. Proses ini jauh lebih rumit dibandingkan proses analog
pada bakteri, di mana RNA polimerase berhenti pada sinyal terminasi
dan melepaskan kedua transkrip 3’ dan cetakan DNA (lihat Gambar 11).
102
mRNA Eukariotik yang matang secara selektif diekspor
dari nukleus
Kita telah melihat bagaimana sintesis dan pemrosesan
pre-mRNA eukariotik berlangsung secara teratur di dalam
inti sel. Namun, peristiwa ini menciptakan masalah khusus
untuk sel eukariotik, terutama yang berasal dari organisme
kompleks di mana intron jauh lebih lama dibandingkan ekson.
Dari pra-mRNA yang disintesis, hanya sebagian kecil
mRNA matang yang dipakai lebih lanjut untuk sel.
Sisanya intron yang dipotong, RNA yang rusak, dan pra-
mRNA yang diproses secara tidak adil tidak hanya tidak
berguna namun berpotensi berbahaya. Lalu bagaimana sel
dapat membedakan antara molekul mRNA matang yang
relatif langka yang ingin disimpannya dan jumlah puing
yang luar biasa dari pemrosesan RNA?
Jawabannya yaitu bahwa, saat molekul RNA
diproses, ia kehilangan protein tertentu dan memperoleh
yang lain, sehingga menandakan keberhasilan penyelesaian
setiap langkah yang berbeda. Sebagai contoh, kita telah
melihat bahwa perolehan kompleks ikatan-pengikat,
kompleks sambungan ekson, dan protein pengikat poli-A
103
menandai penyelesaian penambahan capping, splicing, dan
poli-A secara berurutan. Molekul mRNA yang diselesaikan
dengan baik juga dibedakan oleh protein yang kurang.
Misalnya, kehadiran snRNP akan menandakan
penyambungan tidak lengkap atau menyimpang. Hanya
saat protein hadir pada molekul mRNA secara kolektif
menandakan bahwa pemrosesan berhasil diselesaikan yaitu
mRNA yang diekspor dari nukleus ke dalam sitosol, di mana
ia dapat diterjemahkan menjadi protein. MRNA yang
diproses secara tidak benar, dan serpihan RNA lainnya
disimpan dalam nukleus, di mana mereka akhirnya
terdegradasi oleh exosome nuklir, kompleks protein besar
yang interiornya kaya dengan 3’-5’ RNA exonucleases. Sel-
sel eukariotik dengan demikian hanya mengekspor molekul
RNA yang bermanfaat ke sitoplasma, sementara serpihan
dibuang di dalam nucleus.
Dari semua protein yang berkumpul pada molekul pra-
mRNA saat mereka muncul dari transkrip RNA
polimerase, yang paling banyak yaitu hnRNPs (protein
ribonuclear nuklir heterogen) (lihat Gambar –33). Beberapa
protein ini (ada sekitar 30 di antaranya pada manusia)
104
melepaskan helai jepit rambut dari RNA sehingga splicing
dan sinyal lain pada RNA dapat dibaca dengan lebih mudah.
Yang lain secara istimewa mengemas RNA yang terkandung
dalam sekuens intron yang sangat panjang yang biasanya
ditemukan pada gen organisme kompleks. Karena itu
mereka dapat memainkan peran penting dalam
membedakan mRNA dewasa dari serpihan yang tersisa dari
pemrosesan RNA.
MRNA yang diproses dengan sukses dipandu melalui
kompleks pori nuklir (NPC) saluran berair dalam membran
nuklir yang secara langsung menghubungkan nukleoplasma
dan sitosol (Gambar 39). Molekul kecil (kurang dari 50.000
dalton) dapat berdifusi bebas melalui saluran ini. Namun,
sebagian besar makromolekul dalam sel, termasuk mRNA
yang dikomplekskan dengan protein, terlalu besar untuk
melewati saluran tanpa proses khusus. Sel menggunakan
energi untuk secara aktif mengangkut makromolekul
semacam itu di kedua arah melalui kompleks pori nuklir.
Seperti dijelaskan secara rinci dalam Bab 12,
makromolekul dipindahkan melalui kompleks pori nuklir
oleh reseptor transpor nuklir, yang tergantung pada gigi tiruan
105
dari makromolekul, mengawalinya dari nukleus ke
sitoplasma atau sebaliknya. Agar ekspor mRNA terjadi,
reseptor transpor nuklir spesifik harus dimuat ke mRNA,
suatu langkah yang, setidaknya dalam beberapa organisme,
berlangsung bersamaan dengan pembelahan 3’ dan
poligadenilasi. Setelah itu membantu untuk memindahkan
molekul RNA melalui kompleks pori nuklir, reseptor
transport terdisosiasi dari mRNA, memasuki kembali
nukleus, dan mengekspor molekul mRNA baru (Gambar
40).
Gambar 39 Transportasi molekul mRNA besar melalui kompleks pori
nuklir. (A) Pematangan molekul mRNA karena disintesis oleh RNA
polimerase dan dikemas oleh berbagai protein nuklir. Gambar RNA
berlimpah yang luar biasa ini, disebut Balbiani Ring mRNA, didasarkan
pada mikrograf EM seperti yang ditunjukkan pada (B). Cincin Balbiani
106
ditemukan di sel-sel serangga tertentu. (A, diadaptasi dari B. Daneholt,
Cell 88: 585-588, 1997).
Ekspor kompleks mRNA-protein dari nukleus dapat
diamati dengan mikroskop elektron untuk mRNA berlimpah
yang luar biasa dari gen Cincin Balbiani serangga. saat
gen-gen ini ditranskripsi, RNA yang baru terbentuk terlihat
dipaket oleh protein, termasuk hnRNPs, protein SR, dan
komponen spliceosome. Kompleks protein RNA ini
mengalami serangkaian transisi struktural, mungkin
mencerminkan peristiwa pemrosesan RNA, yang berpuncak
pada serat melengkung (lihat Gambar –39). Serat
melengkung ini bergerak melalui nukleoplasma dan
memasuki kompleks pori nuklir (dengan tutup 5’
melanjutkan terlebih dahulu), dan kemudian mengalami
serangkaian transisi struktural lain saat bergerak melalui
pori. Pengamatan ini dan lainnya mengungkapkan bahwa
kompleks pra-mRNA-protein dan mRNA-protein yaitu
struktur dinamis yang memperoleh dan kehilangan banyak
protein spesifik selama sintesis, pemrosesan, dan ekspor
RNA (lihat Gambar –40).
107
Gambar 40 Ilustrasi skematis dari molekul mRNA "siap-ekspor" dan
transpornya melalui pori nuklir. Seperti yang ditunjukkan, beberapa
protein bergerak dengan mRNA saat bergerak melalui pori-pori,
sedangkan yang lain tetap di dalam nukleus. Reseptor ekspor nuklir
untuk mRNA yaitu kompleks protein yang diendapkan saat mRNA
telah disambungkan dengan benar dan dipoligadenilasi. saat mRNA
diekspor ke sitosol, reseptor ekspor terdisosiasi dari mRNA dan diimpor
kembali ke dalam nukleus, di mana ia dapat dipakai kembali. Tepat
setelah ia meninggalkan nukleus, dan sebelum ia kehilangan kompleks
pengikat (CBC), mRNA dikenai pemeriksaan akhir, yang disebut
peluruhan yang dimediasi nonsense, yang akan dijelaskan nanti dalam
bab ini. Setelah lulus tes ini mRNA terus melepaskan protein yang
sebelumnya terikat dan memperoleh yang baru sebelum diterjemahkan
secara efisien menjadi protein. EJC, kompleks persimpangan ekson.
Seperti yang telah kita lihat, beberapa protein ini
menandai berbagai tahap pematangan mRNA; protein lain
yang disimpan pada mRNA saat masih dalam nukleus
dapat mempengaruhi nasib RNA setelah diangkut ke sitosol.
108
Dengan demikian, stabilitas mRNA dalam sitosol, efisiensi
yang diterjemahkan ke dalam protein, dan tujuan utamanya
dalam sitosol semua dapat ditentukan oleh protein yang
diperoleh dalam nukleus yang tetap terikat pada RNA
setelah ia meninggalkan nukleus. Kita akan membahas
masalah ini di Bab 7 saat kita beralih ke kontrol pasca-
transkripsi ekspresi gen.
Kita telah melihat bahwa sintesis dan pemrosesan
RNA sangat erat digabungkan dalam sel, dan mungkin
diharapkan bahwa ekspor dari nukleus entah bagaimana
terintegrasi dengan kedua proses ini. Meskipun RNA cincin
Balbiani dapat dilihat bergerak melalui nukleoplasma dan
keluar melalui pori-pori nuklir, mRNA lain tampaknya
disintesis dan diproses dalam jarak dekat dengan kompleks
pori nuklir. Dalam kasus-kasus ini, yang mungkin mewakili
sebagian besar gen eukariotik, sintesis mRNA, pemrosesan,
dan transpor semuanya tampak sangat erat; mRNA dengan
demikian dapat dilihat sebagai muncul dari pori-pori nuklir
karena mobil yang baru diproduksi mungkin muncul dari
jalur perakitan. Kemudian dalam bab ini, kita akan melihat
bahwa sel melakukan pemeriksaan kontrol kualitas
109
tambahan pada setiap mRNA sebelum diizinkan untuk
diterjemahkan secara efisien menjadi protein.
Sebelum membahas apa yang terjadi pada mRNA
setelah mereka meninggalkan nukleus, kami secara singkat
mempertimbangkan bagaimana sintesis dan pemrosesan
molekul RNA nonkode terjadi. Meskipun ada banyak
contoh lain, diskusi kami berfokus pada rRNA yang sangat
penting untuk menerjemahkan mRNA menjadi protein.
Banyak RNA Nonkoding Juga Disintesis dan Diproses
dalam Inti
Beberapa persen dari berat kering sel mamalia yaitu
RNA; dari itu, hanya sekitar 3-5% yaitu mRNA. Sebagian
kecil dari sisanya merupakan urutan intron sebelum
terdegradasi, namun sebagian besar RNA dalam sel
melakukan fungsi struktural dan katalitik (lihat Tabel-1, hal.
336). RNA yang paling melimpah dalam sel yaitu RNA
ribosom (rRNA), yang merupakan sekitar 80% dari RNA
dalam sel yang membelah dengan cepat. Sebagaimana
dibahas nanti dalam bab ini, RNA ini membentuk inti dari
ribosom. Tidak seperti bakteri di mana RNA polimerase
110
tunggal mensintesis semua RNA di dalam sel eukariotik
memiliki polimerase khusus, RNA polimerase I, yang
didedikasikan untuk memproduksi rRNA. RNA polimerase
I mirip secara struktural dengan RNA polimerase II yang
dibahas sebelumnya; Namun, tidak adanya ekor terminal-C
dalam polimerase I membantu menjelaskan mengapa
transkripnya tidak dibatasi atau di polyadenylated. Seperti
disebutkan sebelumnya, perbedaan ini membantu sel
membedakan antara RNA nonkoding dan mRNA
Karena beberapa putaran terjemahan setiap molekul
mRNA dapat memberikan amplifikasi yang sangat besar
dalam produksi molekul protein, banyak protein yang sangat
berlimpah dalam sel dapat disintesis dari gen yang hadir
dalam satu salinan per genom haploid. Sebaliknya,
komponen RNA ribosom yaitu produk gen akhir, dan sel
mamalia
.jpg)
