tidak saling menempel
tutup permukaan berperekat dengan bahan berpori steril
yang sesuai (misal kasa steril), lalu pindahkan
lembaran transdermal dalam wadah berisi pengencer
yang mengandung polisorbat 80 P atau lesitin dengan
volume yang sesuai. Kocok kuat selama tidak kurang
dari 30 menit.
INOKULASI DAN PENGENCERAN
Tambahkan suspensi mikroba uji pada sampel dan
suspensi kontrol (pengencer tanpa sampel) seperti tertera
di atas, untuk mendapatkan inokulum dengan jumlah
tidak lebih dari 100 koloni. Volume suspensi inokulum
tidak lebih dari 1% dari volume sediaan yang
diencerkan.
Untuk menampilkan perolehan kembali mikroba uji
yang dapat diterima dari sediaan, faktor pengenceran
terendah dari sampel yang disiapkan harus dipakai
untuk pengujian. Jika hal ini tidak memungkinkan
sebab adanya aktifitas antimikroba atau kelarutan
- 1346 -
sediaan yang rendah, perlu dikembangkan protokol uji
yang sesuai. Jika sifat penghambatan pertumbuhan dari
sampel tidak dapat dihindari, maka jumlah total suspensi
mikroba uji mungkin harus ditambah sesudah proses
netralisasi dengan pengenceran atau penyaringan.
NETRALISASI/PENGHILANGAN
AKTIFITAS ANTIMIKROBA
Jumlah perolehan kembali mikroba uji dari sampel
yang disuspensikan seperti tertera pada Inokulasi dan
Pengenceran, diinkubasi mengikuti procedure yang
tertera pada Perolehan kembali mikroba uji dalam
sediaan, dibandingkan dengan jumlah mikroba uji yang
diperoleh kembali dari suspensi kontrol.
Jika pertumbuhan terhambat (dengan faktor reduksi
lebih besar dari 2), maka lakukan perubahan procedure
untuk penghitungan khusus untuk meyakinkan validitas
hasil. Beberapa contoh perubahan procedure yaitu dengan :
(1) Penambahan jumlah volume pengencer atau
media biakan;
(2) Penambahan larutan penetral khusus atau umum
pada pengencer;
(3) Penyaringan membran; atau
(4) Kombinasi perubahan di atas.
Zat Penetral Zat penetral dipakai untuk
menetralkan aktifitas senyawa antimikroba. (seperti
tertera pada Tabel 2). Zat ini dapat ditambahkan
pada pengencer atau media yang sesuai sebelum
disterilkan. Jika dipakai metode ini , efikasi dan
hilangnya toksisitas terhadap mikroba harus dibuktikan
dengan melakukan penambahan zat penetral pada
blangko tanpa sediaan.
Tabel 2
Zat Penetral Umum / Metode untuk
Zat Penghambat
Zat Penghambat Zat Penetral
Potensial/Metode
Glutaraldehid, raksa Natrium hidrogen sulfit
(Natrium bisulfit)
Fenolik, alkohol,
aldehid, sorbat Pengenceran
Senyawa amonium
kuartener,
parahidroksibenzoat
(paraben), bis-
biguanida
Lesitin
Senyawa amonium
kuartener, iodin,
paraben
Polisorbat
Raksa Tioglikolat
Raksa, halogen,
aldehid Tiosulfat
EDTA(edetat) Ion Mg atau Ca
Jika tidak dapat ditemukan metode netralisasi yang
sesuai, dapat diartikan bahwa kegagalan isolasi mikroba
yang diinokulasikan disebabkan oleh aktivitas
antimikroba dari sediaan. Hal ini menampilkan bahwa
sediaan tidak terkontaminasi mikroba uji. Ulangi
pengujian dengan pengenceran yang lebih tinggi yang
sesuai dengan pertumbuhan mikroba uji dan kriteria
penerimaan khusus.
PEROLEHAN KEMBALI MIKROBA UJI
DALAM SEDIAAN
Untuk tiap mikroba yang terdaftar, lakukan uji
terpisah. Hanya mikroba yang ditambahkan yang
dihitung.
Penyaringan Membran pakailah penyaring
membran dengan porositas tidak lebih dari 0,45 μm.
Jenis bahan penyaring dipilih sedemikian rupa sesampai
kemampuan menahan bakteri tidak dipengaruhi oleh
kandungan sampel uji. pakailah satu jenis membran
penyaring untuk tiap mikroba uji.
Pindahkan beberapa suspensi sampel yang disiapkan
seperti tertera pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan
Pengenceran serta Netralisasi/ Penghilangan Aktifitas
Antimikroba (minimal mengandung 1 g sediaan, atau
kurang jika diperkirakan jumlah koloni besar) saring
segera dan bilas penyaring membran dengan beberapa
tertentu volume pengencer.
Untuk menentukan angka lempeng total mikroba
aerob (ALT), pindahkan penyaring membran ke
permukaan lempeng media Soybean-Casein Digest Agar
(SCDA). Untuk menentukan Angka Kapang Khamir
(AKK), pindahkan membran ke permukaan lempeng
media Sabouraud Dextrose Agar. Inkubasi cawan seperti
tertera pada Tabel 1. Lakukan pengamatan dan
penghitungan.
Metode Angka Lempeng Total Metode angka
lempeng total dilakukan setidaknya duplo untuk tiap
media, dan hasil merupakan rata-rata hitung jumlah
koloni.
Metode Tuang pakailah cawan Petri berdiameter
9 cm, inokulasikan 1 ml suspensi sampel seperti tertera
pada Preparasi Penyiapan Sampel, Inokulasi dan
Pengenceran serta Netralisasi/Penghilangan Aktifitas
Antimikroba ke dalam tiap cawan dan lalu
tambahkan 15 - 20 ml Soybean-Casein Digest Agar atau
Sabouraud Dextrose Agar pada suhu tidak lebih dari 45°.
Jika dipakai cawan Petri yang lebih besar, sesuaikan
jumlah media. Lakukan duplo untuk tiap mikroba uji
yang tercantum pada Tabel 1.
Inkubasi cawan seperti tertera pada Tabel 1. Hitung
jumlah koloni rata-rata dari tiap cawan media dan
jumlah koloni inokulum awal.
Metode Sebar Untuk lempeng media pakailah cawan
Petri diameter 9 cm, diisi 15-10 ml Soybean-Casein
Digest Agar atau Sabouraud Dextrose Agar pada suhu
lebih kurang 45° pada tiap cawan Petri, dan biarkan
memadat. Jika dipakai cawan Petri yang lebih besar,
sesuaikan jumlah media. Keringkan permukaan lempeng
media dalam lemari laminar-airflow atau dalam
- 1347 -
inkubator. Lakukan duplo untuk tiap mikroba uji yang
tertera pada Tabel 1. Inokulasikan 0,1 ml suspensi
sampel yang disiapkan seperti pada Penyiapan Sampel,
Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/
Penghilangan Aktifitas Antimikroba dengan
menyebarkan pada permukaan lempeng media. Inkubasi
dan hitung jumlah koloni seperti telah dijelaskan pada
Metode Tuang.
Metode Angka Paling Mungkin (APM) Presisi
maupun akurasi Metode APM kurang dibandingkan
dengan Metode Penyaringan Membran atau Metode Angka
Lempeng Total. Hasilnya tidak dapat diandalkan terutama
untuk penghitungan khamir. Metode APM dapat
dipakai untuk menghitung ALT jika tidak ada metode
lain yang sesuai dan jika telah ditetapkan sebagai metode
pilihan.
Siapkan minimal tiga seri pengenceran (10-1, 10-2,
10-3) suspensi sediaan dengan cara seperti tertera pada
Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta
Netralisasi/Penghilangan Aktifitas Antimikroba. Dari
tiap tingkat pengenceran suspensi sediaan inokulasikan
masing-masing 1 ml ke dalam tiga seri tabung berisi
9 – 10 ml media Soybean-Casein Digest Broth. Jika
perlu tambahkan surfaktan seperti polisorbat 80 P atau
inaktivator zat antimikroba ke dalam media. Jika dibuat
tiga tingkat pengenceran, maka diperoleh 9 tabung
terinokulasi. Inkubasi semua tabung yang telah
diinokulasi pada suhu 30° - 35° selama tidak lebih dari
3 hari. Jika ada kesulitan dalam membaca hasil, atau
ketidakyakinan terhadap sifat dari sediaan yang diuji,
lakukan sub-kultur pada media yang sama atau Soybean
Casein Digestic Agar selama satu sampai 2 hari pada
suhu yang sama, pakailah hasil ini. Dengan
memakai Tabel 3 dapat ditentukan angka paling
mungkin (APM) per g atau ml sediaan uji.
Tabel 3 Nilai Angka Paling Mungkin Mikroba
Kombinasi Jumlah
Tabung Pada Tiap Seri
yang menampilkan
Pertumbuhan
APM
per g atau per
mL sediaan
Batas
Kepercayaa
n 95%
Jumlah g atau mL
sediaan per tabung
0,1 0,01 0,001
0 0 0 <3 0 - 9,4
0 0 1 3 0,1 - 9,5
0 1 0 3 0,1 - 10
0 1 1 6,1 1,2 - 17
0 2 0 6,2 1,2 - 17
0 3 0 9,4 3,5 - 35
1 0 0 3,6 0,2 - 17
1 0 1 7,2 1,2 - 17
1 0 2 11 4 - 35
1 1 0 7,4 1,3 - 20
1 1 1 11 4 - 35
1 2 0 11 4 - 35
1 2 1 15 5 - 38
1 3 0 16 5 - 38
2 0 0 9,2 1,5 - 3,5
2 0 1 14 4 - 35
2 0 2 20 5 - 38
2 1 0 15 4 - 38
2 1 1 20 5 - 38
2 1 2 27 9 - 94
2 2 0 21 5 - 40
2 2 1 28 9 - 94
2 2 2 35 9 - 94
2 3 0 29 9 - 94
2 3 1 36 9 - 94
3 0 0 23 5 - 94
3 0 1 38 9 - 104
3 0 2 64 16 - 181
3 1 0 43 9 - 181
3 1 1 75 17 - 199
3 1 2 120 30 - 360
3 1 3 160 30 - 380
3 2 0 93 18 - 360
3 2 1 150 30 - 380
3 2 0 93 18 - 360
3 2 2 210 30 - 400
3 2 3 290 90 - 990
3 3 0 240 40 - 990
3 3 1 460 90 - 1980
3 3 2 1100 200 - 4000
3 3 3 >1100
HASIL DAN INTERPRETASI
Jika ada kesesuaian antara Metode Penyaringan
Membran atau Metode Angka Lempeng, hitung jumlah
rata-rata mikroba uji dengan nilai penerimaan tidak lebih
dari faktor 2 suspensi kontrol tanpa sediaan seperti
tertera pada Inokulasi dan Pengenceran.
Jika ada kesesuaian dengan Metode APM nilai
inokulum yang dihitung harus dalam batas kepercayaan
95% dari nilai suspensi kontrol.
Jika kriteria ini di atas tidak dapat dipenuhi
untuk satu atau lebih mikroba yang diuji dengan metode
ini di atas, maka metode dan kondisi uji harus
mendekati kriteria yang dipakai untuk menguji
sediaan.
PENGUJIAN SEDIAAN
Jumlah Sediaan yang dipakai untuk Pengujian
Jika tidak dinyatakan lain pakailah 10 g atau 10 ml
sediaan uji yang diambil dengan cara seperti di atas.
Untuk sediaan cairan atau padatan dalam aerosol
pakailah 10 wadah sampel, demikian juga untuk sampel
“transdermal patches”.
Jumlah yang diuji dapat dikurangi untuk sediaan
dengan bahan aktif yang dibuat dalam tiap unit dosis
(contoh tablet, kapsul, injeksi) kurang dari atau sama
dengan 1 mg, atau jumlah per g atau ml (untuk
penyiapan sampel tidak dalam unit dosis) kurang dari
- 1348 -
1 mg. Dalam hal ini jumlah sampel yang diuji tidak
kurang dari 10 unit dosis atau 10 g atau 10 ml sediaan.
Untuk bahan aktif dengan jumlah sampel terbatas
atau ukuran bets sangat kecil (misalnya kurang dari
1000 ml atau 1000 g) jumlah sampel yang diuji harus
1% dari bets kecuali jumlah yang lebih kecil ditentukan
atau dinyatakan dan disetujui.
Untuk sediaan dengan total keseluruhan bets kurang
dari 200 unit (misal sampel untuk uji klinis), ukuran
sampel dapat dikurangi menjadi dua unit atau satu unit
jika kurang dari 100 unit.
Ambil sampel secara acak dari ruahan sediaan atau
dari wadah yang tersedia pada saat pengerjaan. Untuk
mendapatkan jumlah yang diperlukan, campurkan
beberapa isi wadah sampai mencapai jumlah sampel
yang cukup.
Pemeriksaan Sediaan
PENYARINGAN MEMBRAN
pakailah alat penyaring yang dirancang sedemikian
rupa sesampai memungkinkan pemindahan membran
penyaring ke media. Siapkan sampel memakai
metode yang tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian
Metode Penghitungan, pindahkan beberapa yang sesuai
pada dua penyaring membran, saring segera. Bilas tiap
penyaringan sesuai dengan procedure .
Untuk menentukan ALT, pindahkan satu penyaring
membran ke permukaan Soybean-Casein Digestic Agar.
Untuk menentukan AKK, pindahkan satu penyaring
membran yang lain ke permukaan Sabouraud Dextrose
Agar. Inkubasi cawan Soybean-Casein Digest Agar pada
suhu 30° - 35° selama 3 - 5 hari dan cawan Sabouraud
Dextrose Agar pada suhu 20° - 25° selama 5 - 7 hari.
Hitung jumlah koloni per g atau per ml sediaan.
Untuk pengujian sampel “transdermal patches”,
secara terpisah saring 10% dari volume larutan seperti
tertera pada Penyiapan Sampel, pakailah dua penyaring
membran steril. Pindahkan satu membran pada Soybean-
Casein Digest Agar untuk ALT dan membran lainnya
pada Sabouraud Dextrose Agar untuk AKK.
METODE ANGKA LEMPENG TOTAL
Metode Tuang Siapkan sampel memakai metode
yang sesuai seperti tertera pada Uji Fertilitas dan
Kesesuaian Metode Penghitungan. Siapkan untuk
masing-masing media sekurang-kurangnya dua cawan
Petri untuk tiap tingkat pengenceran. Inkubasi cawan
Soybean-Casein Digest Agar pada suhu 30° - 35° selama
3 - 5 hari dan cawan Sabouraud Dextrose Agar pada
suhu 20° - 25° selama 5-7 hari. Pilih cawan dari satu
tingkat pengenceran dengan jumlah koloni tertinggi yang
kurang dari 250 untuk ALT dan 50 koloni untuk AKK.
Hitung jumlah rata-rata koloni dalam media biakan dan
jumlah koloni per g atau per ml sediaan.
Metode Sebar Siapkan sampel dengan metode yang
sesuai seperti tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian
Metode Penghitungan. Siapkan sekurang-kurangnya dua
cawan Petri untuk tiap media dan tiap tingkat
pengenceran. Untuk inkubasi dan penghitungan jumlah
koloni, lakukan seperti tertera pada Metode Tuang.
METODE ANGKA PALING MUNGKIN (APM)
Siapkan dan encerkan sampel dengan metode sesuai
seperti tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian
Metode Penghitungan. Inkubasi semua tabung selama
3-5 hari pada suhu 30° - 35°. Jika perlu lakukan
subkultur, pakailah metode yang sesuai. Catat jumlah
tabung yang menampilkan pertumbuhan mikroba pada
tiap tingkat pengenceran. Tentukan APM mikroba per g
atau ml sediaan berdasarkan Tabel 3.
Interpretasi Hasil
Angka Lempeng Total (ALT) dianggap sama dengan
angka koloni yang ditemukan pada Soybean-Casein
Digest Agar; jika koloni jamur ditemukan pada media
ini, dihitung sebagai bagian dari jumlah ALT. Total
jumlah kapang dan khamir (AKK) dianggap sama
dengan jumlah koloni yang ditemukan pada Sabouraud
Dextrose Agar; jika koloni bakteri ditemukan pada
media ini, maka dihitung sebagai bagian dari AKK. Jika
AKK diperkirakan melebihi kriteria penerimaan
berdasarkan pertumbuhan bakteri, dapat dipakai
Sabouraud Dextrose Agar yang mengandung antibiotik.
Jika penghitungan dilakukan memakai metode APM,
maka nilai penghitungan yang diperoleh merupakan
angka total mikroba aerobik (ALT).
Jika telah ditetapkan kriteria penerimaan untuk mutu
mikrobiologi, maka di-interpretasikan sebagai berikut:
- 101 koloni: maksimal penghitungan yang dapat
diterima = 20;
- 102 koloni: maksimal penghitungan yang dapat
diterima = 200;
- 103 koloni: maksimal penghitungan yang dapat
diterima = 2000; dan seterusnya.
Larutan dan media yang disarankan tertera pada Uji
Mikroba Khusus.
B. PENGUJIAN MIKROBA SPESIFIK
PENDAHULUAN
Pada Bab ini akan dijelaskan tentang Uji Batas
Mikroba Spesifik yang mungkin terdeteksi dengan
kondisi dan metode yang sesuai.
Metode uji dirancang untuk menetapkan suatu produk
memenuhi kriteria mutu secara mikrobiologi. Untuk
pelaksanaan pengujian ikuti petunjuk di bawah ini,
termasuk jumlah sampel dan interpretasi hasil uji.
Metode pilihan termasuk metode otomatik
dimungkinkan untuk dipakai sesudah dibuktikan
kesetaraannya dengan metode farmakope.
- 1349 -
procedure UMUM
Penyiapan sampel dilakukan seperti tertera pada Uji
enumerasi mikroba.
Jika produk yang akan diuji memiliki aktifitas
antimikroba, sebaiknya sifat antimikroba dihilangkan
atau dinetralkan seperti tertera pada Uji enumerasi
mikroba.
Jika dipakai bahan aktif permukaan (surfaktan)
untuk penyiapan sampel, harus dapat dibuktikan sesuai
dan tidak toksik bagi mikroba dan sesuai dengan
inaktivator yang dipakai dalam produk yang diuji
seperti tertera pada Uji enumerasi mikroba.
FERTILITAS DAN DAYA HAMBAT MEDIA,
KESESUAIAN UJI DAN
KONTROL NEGATIF
Kemampuan metode deteksi mikroba yang ada
dalam produk yang diuji harus ditetapkan. Jika ada
perubahan kemampuan dalam pengujian atau ada
perubahan dalam produk yang dapat mempengaruhi
hasil uji, harus dilakukan konfirmasi metode.
Penyiapan Galur Uji
pakailah suspensi galur uji baku yang stabil. Galur uji
dipelihara dengan Teknik Biakan Lot Benih tidak lebih
dari 5 pasase dari master lot benih asli.
MIKROBA AEROB
Biakkan masing-masing galur bakteri di bawah ini,
pisahkan masing-masing dalam wadah berisi media
Soybean-Casein Digest Broth atau Soybean-Casein
Digest Agar, pada suhu 30 - 35 selama 18 - 24 jam.
Biakkan galur uji Candida albicans dalam Sabouraud
Dextrose Agar atau Sabouraud Dextrose Broth, pada
suhu 20 - 25 selama 2 - 3 hari.
Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCIMB
9518, CIP 4.83 atau
NBRC13276
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB
8626, CIP 82.118 atau
NBRC 13275
Escherichia coli ATCC 8739, NCIMB
8545, CIP 53.126 atau
NBRC 3972
Salmonella enterica
subsp enterica serovar
Typhimurium atau
sebagai pilihan lain
ATCC 14028
Salmonella enterica
subsp enterica serovar
Abony
NBRC 100797, NCTC
6017 atau CIP 80.39
Candida albicans ATCC 10231, NCPF
3179, IP 48.72 atau NBRC
1594
pakailah Dapar Natrium Klorida–Pepton pH 7 atau
Dapar Fosfat pH 7,2 untuk membuat suspensi uji.
pakailah suspensi ini dalam waktu 2 jam atau jika
dipakai sampai 24 jam harus disimpan pada suhu 2° - 8°.
CLOSTRIDIA
pakailah Clostridium sporogenes seperti ATCC
11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) atau
ATCC 19404 (NCTC 532 atau CIP 79.3). Biakkan galur
uji Clostridia dalam keadaan anaerob pada Reinforce
Medium for Clostridia pada suhu 30 - 35 selama
24 - 48 jam. Sebagai pilihan lain, siapkan dan encerkan
sel vegetatif dalam bentuk suspensi segar. Suspensi
spora stabil pada suhu 2 - 8 selama periode yang
tervalidasi.
Kontrol Negatif
Untuk verifikasi kesesuaian kondisi pengujian, kontrol
negatif dilakukan memakai pelarut yang sesuai
menggantikan sediaan uji. Tidak boleh terjadi
pertumbuhan mikroba. Kontrol negatif juga dilakukan pada
saat dilakukan uji terhadap sediaan seperti tertera pada
Pengujian Sediaan. jika terjadi kegagalan pada
kontrol negatif diperlukan investigasi.
Fertilitas dan Daya hambat Media
Uji setiap bets media siap-pakai, media yang
disiapkan dari media kering atau dari komponen media.
Verifikasi sifat seperti tertera pada Tabel 1.
Uji Fertilitas Media Cair Inokulasikan ke dalam
media yang sesuai, mikroba uji dalam jumlah sedikit
(tidak lebih dari 100 koloni), inkubasi pada suhu
tertentu, tidak lebih dari periode terpendek yang tertera
pada procedure uji. Untuk media cair, pertumbuhan
mikroba uji harus terlihat jelas dan harus sama dengan
inokulum yang telah sesuai dengan hasil uji fertilitas
bets media sebelumnya.
Uji Fertilitas Media Padat pakailah Metode Sebar
seperti tertera pada Metode Tuang dalam Uji enumerasi
mikroba. Inokulasikan masing-masing cawan dengan
beberapa mikroba uji yang sesuai (tidak lebih dari 100
koloni). Inkubasikan pada suhu tertentu tidak lebih dari
periode terpendek seperti tertera dalam procedure uji.
Pertumbuhan mikroba sama dengan inokulum yang telah
sesuai dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.
Uji Daya Hambat Media Cair atau Padat
Inokulasikan beberapa mikroba uji paling sedikit 100
koloni pada beberapa media yang diinkubasi pada suhu
tertentu tidak kurang dari periode terpanjang seperti
tertera pada procedure uji. Tidak boleh ada pertumbuhan
mikroba uji.
“Test for Indicative Properties” pakailah Metode
Sebar seperti tertera pada Metode Tuang dalam Uji
enumerasi mikroba. Inokulasikan masing-masing cawan
dengan mikroba sesuai (tidak boleh lebih dari 100
koloni). Inkubasikan pada suhu tertentu dalam batas uji.
- 1350 -
Ciri koloni mikroba uji harus terlihat jelas dan harus
sama dengan inokulum yang sebelumnya.
Kesesuaian Metode Uji
Untuk masing-masing sediaan baru yang diuji lakukan
penyiapan sampel, seperti tertera pada Pengujian
Sediaan. Pada saat inokulasi suspensi sampel,
tambahkan masing-masing galur mikroba uji tidak lebih
dari 100 koloni dalam media pertumbuhan yang telah
ditentukan.
Lakukan uji seperti tertera pada Pengujian Sediaan
dengan masa inkubasi terpendek.
Mikroba uji spesifik harus dapat dideteksi dengan
reaksi dan sifat-sifat seperti dijelaskan dalam Pengujian
Sediaan.
Modifikasi procedure uji untuk menetralkan aktifitas
antimikroba harus dilakukan (tertera pada
Netralisasi/Penghilangan Aktifitas Antimikroba
dalam Uji Enumerasi Mikroba).
Untuk sediaan yang telah diberi penetral aktivitas
antimikroba dengan mengacu pada procedure yang sesuai,
dan ternyata aktivitas antimikroba tidak dapat
dinetralkan, maka diasumsikan bahwa tidak ada mikroba
yang terhambat dalam sediaan.
Tabel 1 Uji Fertilitas, Penghambatan dan “Test for Indicative Properties”
Uji/Media Sifat Mikroba Uji
Uji Toleransi Empedu Bakteri Gram-
negative
Media Cair Pengkaya Enterobacteriaceae
Mossel
Fertilitas E. coli
P.aeruginosa
Daya hambat S. aureus
Violet Red Bile Glucose Agar Fertilitas + indikatif E.coli
P.aeruginosa
Uji Escherichia coli
MacConkey Broth Fertilitas E.coli
Daya hambat S. aureus
MacConkey Agar Fertilitas + indikatif E.coli
Uji Salmonella
Rappaport Vassiliadis Salmonella
Enrichment Broth
Fertilitas Salmonella enterica subsp.
entericaserovar Typhimurium atau
Salmonella enterica subsp.
entericaserovar Abony
Daya hambat S.aureus
Xylose Lysine Deoxycholate Agar Fertilitas + indikatif Salmonella enterica
subsp.entericaserovar Typhimurium
atau Salmonella enterica subsp.
entericaserovar Abony
Uji Pseudomonas aeruginosa
Cetrimide Agar Fertilitas P.aeruginosa
Daya hambat E.coli
Uji Staphylococcus aureus
Mannitol Salt Agar Fertilitas + indikatif S.aureus
Daya hambat E.coli
Uji Clostridia
Reinforced Medium for Clostridia Fertilitas Cl.sporogenes
Columbia Agar Fertilitas Cl.sporogenes
Uji Candida albicans
Sabouraud Dextrose Broth Fertilitas C.albicans
Sabouraud Dextrose Agar Fertilitas + indikatif C.albicans
- 1351 -
PENGUJIAN SEDIAAN
Uji Toleransi Empedu Bakteri Gram-negatif
Penyiapan sampel dan pra-inkubasi Siapkan sampel
1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak lebih dari 1 g
sampel diuji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba,
pakailah Soybean-Casein Digest Broth sebagai
pengencer, campur, dan inkubasi pada suhu 20° - 25°
selama waktu yang cukup untuk menumbuhkan bakteri
namun tidak cukup untuk memicu multiplikasi mikroba
(biasanya 2 jam tapi tidak boleh lebih dari 5 jam).
Uji negatif Kecuali dinyatakan lain dalam masing-
masing monografi, pakailah 1 g sediaan seperti tertera
pada Penyiapan Sampel dan Pra-inkubasi, dalam media
cair pengkaya Enterobacteriaceae Mossel. Inkubasi pada
suhu 30° - 35° selama 4 - 48 jam. Lakukan subkultur
pada cawan Violet Red Bile Glucose Agar. Inkubasi pada
suhu 30° - 35° selama 18 - 24 jam. Sampel memenuhi
syarat bila tidak ada pertumbuhan koloni.
Uji Kuantitatif
Seleksi dan subkultur Inokulasi beberapa suspensi
dengan penyiapan sampel langsung ke dalam media
Enterobacteria Enrichment Broth Mossel Encerkan
suspensi sampel sampai mengandung 0,1 g, 0,01 g dan
0,001 g (atau 0,1 ml, 0,01 ml dan 0,001 ml), dan inkubasi
pada suhu 30° - 35° selama 24 - 48 jam. Lakukan sub-
kultur dengan menginokulasi masing-masing biakan pada
cawan media Violet Red Bile Glucose Agar, inkubasi
pada suhu 30° - 35° selama 18 - 24 jam.
Interpretasi Hasil positif ditunjukkan dengan adanya
pertumbuhan koloni.
Catat hasil positif pada jumlah terkecil sediaan dan hasil
negatif pada jumlah terbesar sediaan. Tentukan Angka
Paling Mungkin (APM) dari bakteri memakai Tabel 2.
Tabel 2 Interpretasi Hasil
Hasil dari masing-masing jumlah
sediaan APM / g atau /ml
sediaan 0,1 g atau
0,1 ml
0,01 g atau
0,01 ml
0,001 g
atau
0,001 ml
+ + + Lebih dari 103
+ + - Kurang dari 103
dan lebih dari 102
+ - - Kurang dari 102
dan lebih dari 10
- - - Kurang dari 10
Escherichia coli
Penyiapan sampel dan pra inkubasi Siapkan sampel
memakai 1 dalam 10 volume pengencer dimana
tidak kurang dari 1 g sediaan diuji seperti tertera pada Uji
Enumerasi Mikroba. pakailah 10 ml atau beberapa sesuai
sampai 1 g atau 1 ml, inokulasi ke dalam media Soybean-
Casein Digest Broth, dengan jumlah seperti tertera dalam
Kesesuaian Metode Uji, campur dan inkubasi pada suhu
30° - 35° selama 18 - 24 jam.
Seleksi dan Subkultur Kocok wadah, pindahkan 1 ml
biakan Soybean-Casein Digest Broth ke dalam 100 ml
MacConkey Broth, inkubasi pada suhu 42° - 44° selama
24 - 48 jam. Inokulasi biakan MacConkey Broth pada
cawan media Mac Conkey Agar, suhu 30° - 35° selama
18 - 72 jam.
Interpretasi Pertumbuhan koloni menampilkan
adanya E.Coli yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada koloni
yang tumbuh atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi
negatif.
Salmonella
Penyiapan sampel dan Pra-inkubasi Siapkan sediaan
uji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. pakailah
jumlah yang sesuai, tidak kurang dari 10 g atau 10 ml,
inokulasi ke dalam beberapa volume Soybean-Casein
Digest Broth yang sesuai (seperti tertera pada Kesesuaian
Metode Uji), campur dan inkubasi pada suhu 30° - 35°
selama 18 - 24 jam.
Seleksi dan Subkultur Pindahkan 0,1 ml biakan
Soybean-Casein Digest Broth ke dalam 10 ml media
Rappaport Vasiliadis Salmonella Enrichment Broth,
inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 24 jam.
Subkultur pada cawan Xylose Lysine Deoxycholate Agar,
inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 48 jam.
Interpretasi Pertumbuhan koloni berwarna merah,
dengan atau tanpa titik hitam di bagian tengah
menampilkan karakteristik Salmonella yang dikonfirmasi
dengan uji identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat jika koloni yang tumbuh
tidak seperti diuraikan di atas atau jika hasil uji
konfirmasi identifikasi negatif.
Pseudomonas aeruginosa
Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi Siapkan
sampel memakai 1 dalam 10 volume pengencer
dimana tidak lebih dari 1 g sediaan diuji seperti tertera
pada Uji Enumerasi Mikroba. pakailah 10 ml atau
jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 ml, inokulasi ke
dalam media Soybean-Casein Digest Broth, dengan
jumlah yang sesuai (seperti tertera pada Kesesuaian
Metode Uji), campur dan inkubasi pada suhu 30° - 35°
selama 18 - 24 jam.
Untuk menguji “transdermal patches”, pakailah
membran penyaring steril, saring beberapa volume
sampel yang sesuai dengan satu “patch” (lihat
“Transdermal Patches” pada Penyiapan Sampel dalam
Uji Enumerasi Mikroba) dan masukkan penyaring
membran ke dalam 100 ml media Soybean-Casein Digest
Broth. Inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 24 jam.
Seleksi dan Subkultur Lakukan subkultur pada cawan
media Cetrimide Agar dan inkubasi pada suhu 30° - 35°
selama 18 - 72 jam.
- 1352 -
Interpretasi Pertumbuhan koloni menampilkan
adanya P.aeruginosa yang dikonfirmasi dengan uji
identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat jika koloni yang tumbuh
tidak seperti diuraikan di atas atau jika hasil uji
konfirmasi identifikasi negatif.
Staphylococcus aureus
Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi Siapkan
sampel memakai 1 dalam 10 volume pengencer
dimana tidak kurang dari 1 g sediaan diuji seperti tertera
pada Uji Enumerasi Mikroba. pakailah 10 ml atau
jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 ml, inokulasi ke
dalam media Soybean-Casein Digest Broth, dengan
jumlah yang sesuai (seperti tertera pada Kesesuaian
Metode Uji) campur dan inkubasi pada suhu 30° - 35°
selama 18 - 24 jam.
Untuk menguji “transdermal patches”, pakailah
membran penyaring steril, saring beberapa volume
sampel yang sesuai dengan satu “patch” (lihat
“Transdermal Patches” pada Penyiapan Sampel
dalamUji Enumerasi Mikroba) dan masukkan penyaring
membran ke dalam 100 ml media Soybean-Casein
Digest Broth. Inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 -
24 jam.
Seleksi dan Subkultur Lakukan subkultur pada cawan
media Mannitol Salt Agar dan inkubasi pada suhu 30° -
35° selama 18 - 72 jam.
Interpretasi Pertumbuhan koloni berwarna kuning
atau putih dikelilingi zona kuning menampilkan adanya
S.aureus yang di konfirmasi dengan uji identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat uji jika pertumbuhan koloni
tidak seperti diuraikan atau jika hasil uji konfirmasi
identifikasi negatif.
Clostridia
Penyiapan Sampel dan Perlakuan Panas Siapkan
sampel memakai 1 dalam 10 volume pengencer
(dengan total volume minimum 20 ml) tidak kurang dari
2 g atau 2 ml sediaan untuk diuji seperti tertera pada Uji
Enumerasi Mikroba. Pisahkan sampel menjadi dua
bagian, sekurang-kurangnya 10 ml. Panaskan satu bagian
pada 80° selama 10 menit, dinginkan dengan cepat. Satu
bagian lainnya tidak dipanaskan.
Seleksi dan Subkultur pakailah 10 ml atau jumlah
yang sesuai dengan 1 g atau 1 ml lalu keduanya
diinokulasi ke dalam beberapa Reinforced Medium for
Clostridia yang sesuai, (seperti tertera pada Kesesuaian
Metode Uji). Inkubasi pada kondisi anaerob pada suhu
30° - 35° selama 48 - 72 jam.
Interpretasi Pertumbuhan koloni anaerob bentuk
batang (dengan atau tanpa endospora) memberi reaksi
katalase negatif, menampilkan adanya Clostridia yang
dikonfirmasi dengan uji identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada koloni
yang tumbuh atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi
negatif.
Candida albicans
Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi Siapkan
sediaan yang akan diuji seperti tertera pada Uji
Endumerasi Mikroba. pakailah 10 ml atau jumlah yang
sesuai tidak kurang dari 1 g atau 1 ml, inokulasi ke dalam
100 ml media Sabouraud Dextrose Broth, campur dan
inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 3 - 5 hari.
Seleksi dan Subkultur Lakukan subkultur pada cawan
Sabouraud Dextrose Agar, dan inkubasi pada suhu 30° -
35° selama 24 - 48 jam.
Interpretasi Adanya pertumbuhan koloni berwarna
putih menampilkan adanya C.albicans. yang dikonfirmasi
dengan uji identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada pertumbuhan
koloni seperti diuraikan di atas atau jika hasil uji
konfirmasi identifikasi negatif.
LARUTAN DAN MEDIA KULTUR
YANG DISARANKAN
[Catatan Bagian ini sebagai informasi.]
Larutan dan media kultur berikut memenuhi tujuan
seperti tertera pada uji kontaminasi mikroba dalam
Farmakope. Media lain mungkin dapat dipakai sesudah
kesesuaiannya dibuktikan.
Larutan Dapar Persediaan Timbang 34 g Kalium
Dihidrogen Fosfat P, masukkan ke dalam labu tentukur
1000 ml, larutkan dalam 500 ml air, atur pH menjadi
7,2±0,2, tambahkan air murni sampai tanda, dan campur
homogen.
Masukkan ke dalam wadah, dan sterilisasi. Simpan
pada suhu 2° - 8°.
Larutan Dapar Fosfat pH 7,2 Siapkan campuran air
murni dan Larutan Dapar persediaan (800:1 v/v),
lalu sterilisasi.
Larutan Dapar Natrium Klorida – Pepton pH 7,0
Kalium dihidrogen fosfat 3,6 g
Dinatrium hidrogen fosfat
dihidrat
7,2 g (setara
0,067 M fosfat)
Natrium klorida 4,3 g
Pepton (daging atau kasein) 1,0 g
Air murni 1000 ml
Sterilisasi memakai otoklaf dengan siklus yang
tervalidasi.
Soybean-Casein Digest Broth
Pancreatic digest of casein 17,0 g
Papaic digest of soybean 3,0 g
Natrium klorida 5,0 g
Dibasa hidrogen fosfat 2,5 g
Glukosa monohidrat 2,5 g
Air murni 1000 ml
Atur pH sesampai sesudah sterilisasi menjadi 7,3±0,2
pada suhu 25°. Sterilisasi memakai otoklaf dengan
siklus yang tervalidasi.
- 1353 -
Soybean-Casein Digest Agar
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Papaic digest of soybean 5,0 g
Natrium klorida 5,0 g
Agar 15,0 g
Air murni 1000 ml
Atur pH sesampai sesudah sterilisasi menjadi 7,3±0,2 pada
suhu 25°. Sterilisasi memakai otoklaf dengan siklus
yang tervalidasi.
Sabouraud Dextrose Agar
Dekstrosa 40,0 g
Mixture peptic digest of animal
tissue and pancreatic digest of
casein (1:1)
10,0 g
Agar 15,0 g
Air murni 1000 ml
Atur pH sesampai sesudah sterilisasi menjadi 5,6±0,2 pada
suhu 25°. Sterilisasi memakai otoklaf dengan siklus
yang tervalidasi.
Potato Dextrose Agar
Infusion from potatoes 200 g
Dekstrosa 20,0 g
Agar 15,0 g
Air murni 1000 ml
Atur pH sesampai sesudah sterilisasi menjadi 5,6±0,2 pada
suhu 25°. Sterilisasi memakai otoklaf dengan siklus
yang tervalidasi.
Sabouraud Dextrose Broth
Dekstrosa 20,0 g
Mixture Peptic Digest of Animal
Tissue and Pancreatic Digest of
Casein (1:1)
10,0 g
Air murni 1000 ml
Atur pH sesampai sesudah sterilisasi menjadi 5,6±0,2 pada
suhu 25°. Sterilisasi memakai otoklaf dengan siklus
yang tervalidasi.
Enterobacteria Enrichment Broth Mossel
Pancreatic digest of gelatin 10,0 g
Glukosa monohidrat 5,0 g
Dehydrated ox bile 20,0 g
Kalium dihidrogen fosfat 2,0 g
Dinatrium hydrogen fosfat
dihidrat
8,0 g
Brilliant green 15 mg
Air murni 1000 ml
Atur pH sesampai sesudah sterilisasi menjadi 7,2±0,2 pada
25°. Panaskan sampai 100º selama 30 menit dan
dinginkan segera.
Violet Red Bile Glucose Agar
Yeast extract 3,0 g
Pancreatic digest of gelatin 7,0 g
Bile salts 1,5 g
Natrium klorida 5,0 g
Glukosa monohidrat 10,0 g
Agar 15,0 g
Merah netral 30 mg
Kristal violet 2 mg
Air murni 1000 ml
Atur pH sesampai sesudah sterilisasi menjadi 7,4±0,2 pada
25°. Panaskan sampai mendidih, jangan dipanaskan
memakai otoklaf.
MacConkey Broth
Pancreatic digest of gelatin 20,0 g
Laktosa monohidrat 10,0 g
Dehydrated ox bile 5,0 g
Ungu bromokresol 10 mg
Air murni 1000 ml
Atur pH sesampai sesudah sterilisasi menjadi 7,3±0,2 pada
25°. Sterilisasi memakai otoklaf dengan siklus yang
tervalidasi.
MacConkey Agar
Pancreatic digest of gelatin 17,0 g
Peptones (meat and casein) 3,0 g
Laktosa monohidrat 10,0 g
Natrium klorida 5,0 g
Bile salts 1,5 g
Agar 13,5 g
Merah netral 30,0 mg
Kristal violet 1 mg
Air murni 1000 ml
Atur pH sesampai sesudah sterilisasi menjadi 7,1±0,2 pada
suhu 25º. Didihkan selama 1 menit dengan pengadukan
konstan, lalu sterilisasi memakai otoklaf
dengan siklus yang tervalidasi.
Rappaport Vassiliadis Salmonela Enrichment Broth
Soya peptone 4,5 g
Magnesium klorida heksahidrat 29,0 g
Natrium klorida 8,0 g
Dikalium fosfat 0,4 g
Kalium dihidrogen fosfat 0,6 g
Malachite green 0,036 g
Air murni 1000 ml
Larutkan dalam keadaan agak hangat. Sterilisasi
memakai otoklaf dengan siklus yang tervalidasi,
pada suhu tidak lebih dari 115º. sesudah disterilisasi
memakai otoklaf pH menjadi 5,2±0,2 pada suhu 25º.
Xylose Lysine Deoxycholate Agar
Xylose 3,5 g
L-lysine 5,0 g
Laktosa monohidrat 7,5 g
Sukrosa 7,5 g
Natrium klorida 5,0 g
Yeast extract 3,0 g
Merah fenol 80 mg
Agar 13,5 g
Sodium deoksikolat 2,5 g
- 1354 -
Sodium tiosulfat 6,8 g
Besi (III) ammonium
sitrat
0,8 g
Air murni 1000 ml
Atur pH sesampai sesudah pemanasan menjadi 7,4±0,2
pada suhu 25°. Panaskan sampai mendidih, dinginkan
sampai 50°, tuang ke dalam cawan Petri. Jangan
disterilisasi memakai otoklaf.
ANTIMIKRO B
Panaskan sampai mendidih selama 1 menit dengan
pengocokan. Atur pH sesampai sesudah sterilisasi menjadi
7,2±0,2 pada 25°. Sterilisasi memakai otoklaf
dengan siklus yang tervalidasi.
Mannitol Salt Agar
Pancreatic digest of casein 5,0 g
Peptic digest of animal
tissue
5,0 g
Beef extract 1,0 g
D-manitol 10,0 g
Natrium klorida 75,0 g
Agar 15,0 g
Merah fenol 0,025 g
Air murni 1000 ml
Panaskan sampai mendidih selama 1 menit dengan
pengocokan. Atur pH sesampai sesudah sterilisasi menjadi
7,4±0,2 pada suhu 25°. Sterilisasi memakai otoklaf
dengan siklus yang tervalidasi.
Reinforced Medium for Clostridia
Beef extract 10,0 g
Pepton 10,0 g
Yeast extract 3,0 g
Soluble starch 1,0 g
Glukosa monohidrat 5,0 g
Sistein hidroklorida 0,5 g
Natrium klorida 5,0 g
Natrium asetat 3,0 g
Agar 0,5 g
Air murni 1000 ml
Basahi dan larutkan agar memakai air murni, dan
panaskan sampai mendidih dengan pengadukan secara
terus menerus. Jika diperlukan, atur pH sesampai sesudah
sterilisasi menjadi 6,8±0,2 pada suhu 25°. Sterilisasi
memakai otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.
Columbia Agar
Pancreatic digest of casein 10,0 g
Meat peptic digest 5,0 g
Heart pancreatic digest 3,0 g
Yeast extract 5,0 g
Maized starch 1,0 g
Natrium klorida 5,0 g
Agar, tergantung pada
daya pembentukan gel
10,0-15,0 g
Air murni 1000 ml
Basahi dan larutkan agar memakai air murni, dan
panaskan sampai mendidih dengan pengadukan secara
terus menerus. Jika diperlukan, atur pH sesampai sesudah
sterilisasi menjadi 7,3±0,2 pada suhu 25°. Sterilisasi
memakai otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.
Dinginkan sampai mencapai 45-50°, bila perlu tambahkan
gentamisin sulfat yang setara dengan 20 mg gentamisin
basa, dan tuang ke dalam cawan Petri.
UJI EFEKTIFITAS PENGAWET <61>
Pengawet yaitu zat antimikroba yang ditambahkan pada
sediaan non-steril untuk melindungi sediaan terhadap
pertumbuhan mikroba yang ada atau mikroba yang masuk
secara tidak sengaja selama ataupun sesudah proses
produksi. Dalam sediaan steril dosis ganda, pengawet
ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba
yang mungkin masuk pada pengambilan berulang.
Pengawet tidak boleh dipakai sebagai pengganti
cara produksi yang baik atau semata-mata untuk
menurunkan populasi mikroba “viabel” dari produk tidak
steril atau mengontrol “bioburden” pra-sterilisasi dari
formulasi sediaan dosis ganda pada waktu diproduksi.
Pengawet sesuai bentuk sediaan dalam farmakope
memenuhi syarat untuk Bahan Tambahan dalam
Ketentuan Umum.
Semua bahan antimikroba yang dipakai pada
dasarnya toksik. Untuk melindungi konsumen secara
maksimum, kadar pengawet yang efektif dalam kemasan
akhir produk hendaknya di bawah tingkat toksik bagi
manusia.
Kadar pengawet yang ditambahkan dapat dikurangi jika
bahan aktif dalam formulasi secara intrinsik memiliki
aktivitas antimikroba. Untuk semua produk injeksi dosis
ganda atau produk lain yang mengandung pengawet,
harus menampilkan efektivitas antimikroba baik sebagai
sifat bawaan dalam produk maupun yang dibuat dengan
penambahan pengawet. Efektivitas antimikroba juga
harus ditunjukkan untuk semua produk dosis ganda
sediaan topikal, oral dan sediaan lain seperti tetes mata,
telinga, hidung, irigasi dan cairan dialisis.
Pengujian berikut dimaksudkan untuk menampilkan
efektivitas pengawet. Penambahan pengawet harus
dinyatakan pada etiket. Pengujian dan kriteria untuk
efektivitas berlaku hanya pada produk di dalam wadah
asli belum dibuka yang didistribusikan oleh produsen.
Cetrimide Agar
Pancreatic digest of
gelatin
20,0 g
Magnesium klorida 1,4 g
Dikalium sulfat 10,0 g
Setrimid 0,3 g
Agar 13,6 g
Air murni 1000 ml
Gliserol 10,0 ml
- 1355 -
KATEGORI SEDIAAN
Untuk tujuan pengujian, sediaan dibagi menjadi 4
kategori. Kriteria efektifitas antimikroba untuk sediaan
tergantung cara pemberiannya.
Tabel 1 Kategori Sediaan
Kategori Uraian Sediaan
1
2
3
4
Injeksi, sediaan parenteral lain
termasuk emulsi, sediaan tetes telinga,
sediaan steril tetes hidung, dan sediaan
optalmik yang dibuat dengan dasar atau
pembawa air.
Sediaan topikal yang dibuat dengan
dasar atau pembawa air, sediaan tetes
hidung non-steril, dan emulsi, termasuk
sediaan yang dioleskan ke membran
mukosa.
Sediaan oral selain antasida, dibuat
dengan dasar atau pembawa air.
Antasida yang dibuat dengan pembawa
air.
MIKROBA UJI
pakailah biakan mikroba berikut: Candida albicans
(ATCC No. 10231), Aspergillus niger (ATCC No.
16404), Escherichia coli (ATCC No. 8739),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC No. 9027) dan
Staphylococcus aureus (ATCC No. 6538). Mikroba hidup
yang dipakai untuk pengujian tidak boleh lebih dari
lima pasase dari biakan ATCC asli. Untuk tujuan
pengujian, satu pasase didefinisikan sebagai transfer
mikroba dari biakan yang ditetapkan, ke media segar.
Semua transfer dihitung. Dalam kondisi mikroba yang
dipelihara dengan teknik lot benih, maka setiap siklus
pembekuan, pencairan, dan penumbuhan kembali dalam
media segar, ditetapkan sebagai satu transfer. Teknik lot
benih hendaknya dipakai untuk penyimpanan kultur
jangka panjang. Biakan yang diterima dari ATCC harus
diresusitasi sesuai procedure . Jika ditumbuhkan dalam
media cair, sel diendapkan dengan cara sentrifus.
Suspensikan kembali dalam media cair segar (1:20) dan
tambahkan dengan volume sama campuran gliserol 20%
(v/v dalam air) steril. Sel yang ditumbuhkan dalam media
agar dipanen dari permukaan media ke dalam media cair
gliserol 10%. Bagikan suspensi ini dalam jumlah kecil ke
dalam vial steril. Simpan vial dalam nitrogen cair atau
dalam “freezer” mekanik pada suhu tidak lebih dari 50º.
Jika vial lot benih segar diperlukan, vial ini dapat
dipakai untuk menginokulasi serangkaian kultur kerja.
Kultur kerja ini lalu dapat dipakai secara berkala
(setiap hari untuk bakteri dan khamir) untuk memulai
kultur inokula.
MEDIA
Seluruh media yang dipakai untuk pengujian harus
diuji fertilitas. pakailah mikroba seperti tertera pada
Mikroba uji.
PERSIAPAN INOKULA
Persiapan sebelum pengujian, inokulasikan masing-
masing mikroba spesifik dari stok-biakan segar pada
permukaan media agar yang sesuai.
Tabel 2 Kondisi Biakan Pentuk Penyiapan Inokula
Mikroba Media yang sesuai Suhu Inkubasi Waktu Inkubasi
Inokula
Waktu Inkubasi
Rekoveri Mikroba
Escherichia coli
(ATCC No.8739 )
Soybean-Casein
Digest Broth;
Soybean-Casein
Digest Agar
32,5º±2,5º 18 – 24 jam 3 – 5 hari
Pseudomonas
aeruginosa
(ATCC No. 9027)
Soybean-Casein
Digest Broth;
Soybean-Casein
Digest Agar
32,5º±2,5º 18 – 24 jam 3 – 5 hari
Staphylococcus aureus
(ATCC No. 6538)
Soybean-Casein
Digest Broth;
Soybean-Casein
Digest Agar
32,5º±2,5º 18 – 24 jam 3 – 5 hari
Candida albicans
(ATCC No. 10231)
Sabouraud Dextrose
Agar;
Sabouraud Dextrose
Broth
22,5º±2,5º 44 – 52 jam 3 – 5 hari
- 1356 -
Mikroba Media yang sesuai Suhu Inkubasi Waktu Inkubasi
Inokula
Waktu Inkubasi
Rekoveri Mikroba
Aspergillus niger
(ATCC No. 16404)
Sabouraud Dextrose
Agar;
Sabouraud Dextrose
Broth
22,5º±2,5º 6 – 10 hari 3 – 7 hari
Kondisi biakan untuk inokula dalam media yang sesuai
yaitu Soybean-Casein Digest atau Sabouraud Dextrose
Agar seperti tertera pada Tabel 2 pada lampiran Uji
Batas Mikroba <51>.
Untuk memanen biakan bakteri dan C.albicans
pakailah salin LP steril, cuci biakan yang tumbuh di
permukaan, kumpulkan dalam wadah yang sesuai dan
tambahkan salin LP steril secukupnya sampai diperoleh
suspensi dengan jumlah mikroba lebih kurang 1 x 108
koloni per ml. Untuk memanen biakan A.niger pakailah
salin LP steril yang mengandung 0,05% polisorbat 80 P
dan tambahkan salin LP steril secukupnya sampai
diperoleh suspensi dengan jumlah mikroba lebih kurang
1 x 108 koloni per ml.
Cara lain, mikroba stok-biakan dapat ditumbuhkan
dalam media cair yang sesuai (misalnya Soybean Casein
Digest Broth atau Sabouraud Dextrose Broth) dan sel
mikroba dipanen dengan cara sentrifus lalu dicuci
dan disuspensikan kembali dalam salin LP steril
secukupnya sampai diperoleh suspensi dengan jumlah
mikroba lebih kurang 1 x 108 koloni per ml. [Catatan
Perkiraan kadar inokula dapat dilakukan dengan
pengukuran turbidimetri untuk mikroba tantang. Bila
tidak segera dipakai dalam waktu 2 jam, suspensi
harus disimpan dalam lemari pendingin.]
Tetapkan jumlah koloni per ml dari setiap suspensi,
memakai kondisi media dan waktu inkubasi untuk
rekoveri yang tertera pada Tabel 2 untuk memastikan
perkiraan jumlah awal. Nilai perkiraan ini dipakai
untuk mengkalibrasi ukuran inokula yang dipakai
dalam pengujian. Suspensi bakteri dan khamir harus
dipakai dalam waktu 24 jam dari panen, namun untuk
kapang dapat disimpan dalam lemari pendingin dalam
waktu sampai 7 hari.
procedure
Pengujian dapat dilakukan dalam tiap lima wadah asli
bila volume sediaan tiap wadahnya mencukupi dan
wadah sediaan dapat ditusuk secara aseptik (dengan
jarum dan alat suntik melalui tutup karet elastomerik),
atau dalam lima wadah bakteriologi bertutup steril,
berukuran mencukupi untuk volume sediaan yang
dipindahkan. Inokulasi tiap wadah dengan satu inokula
baku yang telah disiapkan dan diaduk. Volume suspensi
inokula yang dipakai antara 0,5% dan 1,0% dari
volume sediaan. Kadar mikroba uji yang ditambahkan
pada sediaan (Kategori 1, 2, dan 3) seperti halnya kadar
akhir sediaan uji sesudah diinokulasi antara 1 x 105 dan
1 x 106 koloni/ml. Untuk sediaan Kategori 4 (antasida)
kadar akhir sediaan uji sesudah inokulasi antara 1 x 103
dan 1 x 104 koloni/ml.
Kadar awal mikroba “viabel” dalam setiap sediaan uji
diperkirakan berdasarkan kadar mikroba dalam inokula
standar ditetapkan dengan metode angka lempeng total.
Inkubasi wadah yang sudah diinokulasi pada
22,5º ± 2,5º. Ambil sampel dari setiap wadah pada
interval yang sesuai seperti tertera pada Tabel 3. Catat
setiap perubahan penampilan yang diamati pada interval
ini . Tetapkan dengan procedure angka lempeng total
jumlah koloni yang ada dari setiap sediaan uji untuk
interval yang dipakai seperti tertera pada lampiran Uji
Batas Mikroba <51>. Pada uji angka lempeng total atau
pengenceran yang sesuai tambahkan inaktivator
(penetral) antimikroba spesifik. Kondisi ini dipakai
untuk validasi sampel berdasarkan kondisi media dan
waktu inkubasi rekoveri mikroba seperti tertera pada
Tabel 2. Dengan memakai jumlah koloni/ml
terhitung pada awal pengujian, hitung perubahan dalam
nilai log jumlah koloni/ml untuk setiap mikroba yang
dipakai pada setiap interval uji dan nyatakan sebagai
log reduksi.
KRITERIA EFEKTIVITAS ANTIMIKROBA
Persyaratan untuk efektivitas antimikroba dipenuhi
jika kriteria spesifik pada Tabel 3 dipenuhi: Tidak terjadi
peningkatan lebih tinggi dari log 0,5 unit terhadap nilai
log mikroba awal.
Tabel 3 Kriteria untuk Mikroba uji
Untuk Sediaan Kategori 1
Bakteri Koloni tidak kurang dari 1,0 log reduksi
dari jumlah hitungan awal pada hari ke-
7, tidak kurang dari 3,0 log reduksi dari
hitungan awal pada hari ke-14, dan tidak
meningkat sampai dengan hari ke-28.
Kapang
dan khamir
Koloni tidak meningkat dari jumlah
hitungan awal sampai hari ke-7, 14 dan 28.
Untuk Sediaan Kategori 2
Bakteri Koloni tidak kurang dari 2,0 log reduksi
dari jumlah awal pada hari ke-14, dan
tidak meningkat dari hari ke-14 sampai
hari ke-28.
Kapang
dan khamir
Koloni tidak meningkat dari jumlah
hitungan awal sampai hari ke-14 dan 28.
- 1357 -
Untuk Sediaan Kategori 3
Bakteri Koloni tidak kurang dari 1,0 log reduksi
dari jumlah hitungan awal pada hari ke-
14, dan tidak meningkat sampai dengan
hari ke-28.
Kapang
dan khamir
Koloni tidak meningkat dari jumlah
hitungan awal sampai hari ke-14 dan 28.
Untuk Sediaan Kategori 4
Bakteri,
kapang dan
khamir
Koloni tidak meningkat dari jumlah
hitungan awal sampai hari ke-14 dan 28.
UJI KINERJA RESISTENSI INDIKATOR
BIOLOGI <65>
PENGHITUNGAN ANGKA SPORA
Untuk indikator biologi dengan pembawa kertas,
lepaskan tiga buah indikator biologi yang relevan dari
masing-masing wadahnya. Dispersikan kertas pembawa
dengan memasukkan ke dalam 250 ml “blender” steril
berisi 100 ml Air Murni dingin, campurkan sampai
terbentuk suspensi homogen. biasanya pencampuran
dilakukan selama 15 menit atau lebih untuk memperoleh
perolehan kembali yang optimal. Pindahkan beberapa
10 ml alikuot suspensi ke dalam 16 x 125 mm tabung
bertutup ulir steril. Untuk Indikator Biologi Sterilisasi
Uap Basah dengan Pembawa Kertas, panaskan tabung
berisi suspensi dalam tangas air pada 95º - 100º selama
15 menit (syok panas) dimulai sesudah suhu mencapai
95º. Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Panas Kering
dengan Pembawa Kertas dan Indikator Biologi
Sterilisasi Etilen Oksida, dengan Pembawa Kertas,
panaskan tabung berisi suspensi dalam tangas air pada
80º - 85º selama 10 menit dimulai sesudah suhu mencapai
80º. Dinginkan secara cepat dalam tangas air-es pada
0º - 4º. Pindahkan 1 ml alikuot masing-masing ke dalam
dua tabung yang sesuai, dan lakukan seri pengenceran
secukupnya dalam Air Murni steril, pengenceran dipilih
dengan hasil penghitungan 30 - 300 koloni, namun tidak
kurang dari 6, pada tiap pasangan lempeng dengan
perlakuan sebagai berikut ini. Bila indikator biologi
memiliki kadar spora rendah, mungkin seri
pengenceran perlu dimodifikasi dan memakai
lempeng lebih banyak untuk tiap pengenceran. Siapkan
seri terpisah lempeng untuk tiap alikuot. Masukkan
1,0 ml suspensi dari tingkat pengenceran yang dipilih ke
dalam masing-masing dua cawan Petri 15 - 100 mm.
Dalam waktu 20 menit tambahkan pada tiap cawan
20 ml media Soybean-Casein Digest Agar cair dan telah
didinginkan 45º - 50º. Campur dengan memutar cawan
sampai suspensi homogen, dan lalu dibiarkan
memadat. Inkubasikan lempeng dengan posisi dibalik
pada 55º - 60º, untuk Indikator Biologi Sterilisasi Uap
Basah dengan Pembawa Kertas, dan pada 30º - 35º
Indikator Biologi Sterilisasi Etilen Oksida, dengan
Pembawa Kertas dan Indikator Biologi Sterilisasi Panas
Kering dengan Pembawa Kertas atau pada suhu rekoveri
optimal ditentukan dari pabrik. Amati lempeng sesudah
24 dan 48 jam, catat jumlah koloni tiap lempeng; dan
pakailah jumlah koloni yang diamati sesudah 48 jam
untuk menghitung hasil. Hitung jumlah rata-rata spora
tiap indikator dari hasil penghitungan, memakai
faktor pengenceran yang sesuai. Pengujian dinyatakan
absah bila log jumlah spora per (kertas) pembawa pada
48 jam sama atau lebih besar dari log jumlah sesudah
24 jam dalam tiap wadah. Untuk Indikator Biologi
Sterilisasi Uap Basah, Self-Contained lepaskan secara
aseptik tiga buah pembawa dari masing-masing
wadahnya, dan perlakukan langsung seperti pada
Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah dengan
Pembawa Kertas.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Pemanasan Basah,
Pemanasan Kering, dan Gas, dengan Pembawa Non-
Kertas, lepaskan secara aseptik tiga buah pembawa dari
masing-masing kemasan asli atau wadahnya. Masukkan
tiap pembawa ke dalam wadah steril yang sesuai berisi
100 ml Air Murni dingin, dan sonikasi atau kocok
dengan pengocok-resiprok secukupnya. Lima belas
menit atau lebih mungkin diperlukan untuk perolehan
kembali yang optimal. Sebaiknya telah dilakukan studi
pendahuluan untuk memastikan bahwa metode
perolehan kembali menghasilkan sedikitnya 50%-300%
perolehan kembali angka spora hidup. Pindahkan
beberapa 10 ml alikuot suspensi ke dalam 16 x 125 mm
tabung bertutup ulir steril. Panaskan tabung berisi
suspensi Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus
coagulans pada 80º - 85º selama 10 menit. Panaskan
tabung berisi suspensi Geobacillus stearothermophilus
pada 95º - 100º selama 15 menit. Penghitungan waktu
dimulai pada saat tiap rentang suhu pemanasan
mencapai yang terendah. Dinginkan segera dalam tangas
air es pada 0º - 4º. Pindahkan masing-masing 1 ml
alikuot ke dalam dua tabung yang sesuai, dan lakukan
seri pengenceran secukupnya dalam Air Murni steril,
pengenceran dipilih dengan hasil penghitungan 30 - 300
koloni, namun tidak kurang dari 6, pada tiap pasangan
lempeng dengan perlakuan sebagai berikut ini.
Bila indikator biologi memiliki kadar spora rendah,
mungkin seri pengenceran perlu dimodifikasi dan
memakai lempeng lebih banyak untuk tiap
pengenceran. Siapkan seri terpisah lempeng untuk tiap
alikuot. Masukkan 1 ml suspensi dari tingkat
pengenceran yang dipilih ke dalam masing-masing dua
cawan Petri 15 - 100 mm. Dalam waktu 20 menit
tambahkan pada tiap cawan 20 ml media Soybean-
Casein Digest Agar cair dan telah didinginkan 45° - 50º.
Campur dengan memutar cawan sampai suspensi
homogen.
Untuk G.stearothermophilus, B.atrophaeus, B.subtilis,
dan B.coagulans, pakailah media Soybean-Casein Digest
Agar dan inkubasikan lempeng secara aerob dengan
posisi dibalik pada suhu berturut-turut untuk tiap
mikroba sebagai berikut: 55º - 60º, 30º - 35º, 48º - 52º, atau
pada suhu optimum khusus sesuai dengan indikator
biologi pabrik. Amati lempeng sesudah 24 dan 48 jam.
Catat jumlah koloni tiap lempeng. Hitung rata-rata
jumlah spora tiap indikator dari hasil penghitungan,
- 1358 -
memakai faktor pengenceran yang sesuai.
Pengujian dinyatakan absah bila log jumlah spora per
pembawa pada 48 jam sama atau lebih besar dari log
jumlah sesudah 24 jam dalam tiap wadah.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Pemanasan Basah,
Pemanasan Kering, dan Gas, Suspensi Spora Cair,
memakai G.stearothermophilus, B.atrophaeus,
B.subtilis, dan B.coagulans sebagai indikator biologi,
disiapkan seri pengenceran secukupnya, suspensi asli
spora dengan Air Murni dingin steril dalam tabung
bertutup ulir 16 x 125 mm memakai procedure
khusus penghitungan angka spora dengan Indikator
Biologi Sterilisasi Pemanasan Basah, Pemanasan
Kering, dan Gas, dengan Pembawa Non-Kertas.
PENETAPAN NILAI-D
Lakukan seluruh pengujian seperti dijelaskan dalam
bagian ini di bawah kondisi aseptik, memakai
peralatan steril untuk mikroba non-termofilik.
Penetapan Nilai-D untuk G.stearothermophilus dan
B.coagulans dapat dilakukan di lingkungan tidak
diklasifikasi namun terkendali.
Peralatan
Peralatan uji untuk menetapkan resistensi
mikrobiologi yang dijelaskan secara rinci dalam ISO
18472, Sterilisasi Produk Kesehatan-Indikator Biologi
dan Kimia-Peralatan Uji. Rincian Resistometer Evaluasi
Indikator Biologi (REIB) secara individu bervariasi
dengan rancangan spesifik dan proses sterilisasi utama
bersama dengan yang dipakai . Tetapkan bahwa
kinerja bejana REIB sesuai dengan persyaratan standar
ISO untuk paparan indikator biologi, dengan perbedaan
rancangan yang dapat diterima.
procedure
Lakukan pengujian Nilai-D pada setiap pengaturan
kondisi sterilisasi, paket indikator biologi diberi tanda
(label) untuk dipakai . Ambil kelompok spesimen
indikator biologi beberapa yang cukup dalam wadah asli
masing-masing, setiap kelompok terdiri dari tidak
kurang 5 spesimen. Jumlah kelompok menyediakan
rentang pengamatan dari tidak kurang dari satu label
nilai-D di bawah tanda waktu bertahan hidup (”survival
time”) sampai tidak kurang dari satu label nilai-D di atas
tanda waktu mematikan (”kill time”). Letakkan setiap
kelompok pada tempat spesimen (“specimen holder”)
terpisah yang sesuai yang memungkinkan setiap
spesimen terpapar kondisi sterilisasi yang telah
ditentukan pada lokasi khusus dalam bejana sterilisasi
REIB. Periksa alat REIB untuk parameter pengoperasian
memakai “specimen holder” tanpa spesimen. Pilih
seri tambahan waktu sterilisasi dari waktu terpendek
untuk spesimen yang diuji. Perbedaan pada seri waktu
sterilisasi, sedapat mungkin konstan dan perbedaan
antara waktu yang berdekatan tidak lebih besar dari 75%
nilai-D label.
procedure uji pemakaian bejana REIB untuk evaluasi
resistensi mikroba ditetapkan dalam standar ISO seri
11138. Indikator biologi sebaiknya mengikuti standar
yang sesuai. Metode uji dan pemakaian pembawa
dengan REIB mungkin dapat disesuaikan untuk
indikator biologi khusus. Metode dan peralatan yang
dipakai untuk pembawa kertas dapat berbeda dengan
pembawa lain dan secara substansial berbeda dari
pemakaian suspensi indikator biologi.
Kondisi pemaparan nilai-D untuk pembawa bahan
alternatif sama dengan kondisi yang dipakai untuk
menetapkan nilai-D pembawa kertas. Jika label pabrik
membolehkan pemakaian pembawa dengan berbagai
metode sterilisasi, maka data nilai-D, ”survival time”,
“kill time” disediakan oleh pabrik untuk setiap metode
sterilisasi. Hal ini memungkinkan indikator biologi yang
diinokulasi pada pembawa selain kertas disterilisasi/
dekontaminasi dengan metoda gas atau uap seperti tahap
uap hidrogen peroksida dan klorin dioksida.
Standar kondisi fisik evaluasi indikator biologi untuk
pemakaian dengan tahap uap hidrogen peroksida dan
klorin dioksida belum ditetapkan. Dalam hal klorin
dioksida, kadar gas, kelembaban relatif, dan suhu
merupakan pengendali kondisi proses yang penting,
yang dapat diukur dengan akurat. Pabrik penghasil
indikator biologi memakai klorin dioksida harus
menyatakan kondisi yang harus dilakukan di bawah
penetapan nilai-D, sesampai Pemakai dapat paling tidak
melihat resistensi banyak indikator biologi sebagai
pembanding untuk mengantisipasi kondisi yang
dipakai . Situasi dengan tahap uap hidrogen peroksida
lebih kompleks, berbagai peralatan pabrik menawarkan
dekontaminasi atau kondisi sterilisasi yang berbeda. Jadi
tidak ada proses standar untuk melakukan dekontaminasi
dengan tahap uap hidrogen peroksida atau sterilisasi
permukaan. Hal ini diikuti tidak adanya metode evaluasi
standar industri indikator biologi, walaupun mungkin
tidak berhubungan langsung antara kadar uap dan
kecepatan ataupun keefektivan inaktivasi indikator
biologi. Sebagai tambahan, sulit untuk mengases
kelembaban relatif secara akurat, yang sering ditetapkan
sebagai parameter proses kritis dengan adanya uap
hidrogen peroksida. Untuk alasan ini lebih masuk akal
untuk menetapkan resistensi indikator biologi menjadi
relatif atau ukuran relatif pabrik daripada nilai-D
sebenarnya. Selanjutnya tergantung peralatan dan proses
yang dikerjakan, dan ini menjadi tidak mungkin bagi
Pemakai mengulangi uji resistensi biologi yang telah
dilakukan oleh pabrik.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah,
Pemanasan Kering, dan Gas, Suspensi Spora Cair,
dilakukan penetapan nilai-D untuk tiap mikroba untuk
menyediakan suspensi hasil panen spora cair. Uji
dilakukan dengan seri pengenceran berdasarkan status
titer spora dari suspensi dengan Air Murni dalam tabung
steril.
Bila suspensi dimasukkan pada atau dalam substrat
misal tutup elastomerik atau produk formulasi,
resistensinya mungkin berbeda dari yang ditetapkan
dalam Air Murni. Perbedaan itu mungkin bermakna
- 1359 -
untuk pemakaian indikator biologi dan pengukuran
yang sesuai sebelumnya untuk dipakai dalam
aktivitas validasi sterilisasi.
Perolehan Kembali
sesudah melengkapi procedure sterilisasi Indikator
Biologi untuk Sterilisasi Panas Kering dengan Pembawa
Kertas dan Indikator Biologi untuk Sterilisasi Etilen
Oksida, dengan Pembawa Kertas; atau Indikator Biologi
untuk Sterilisasi Uap dengan Pembawa Kertas yang
dapat diterapkan dan dalam catatan waktu tidak lebih
dari 4 jam, buka secara aseptik dan tambahkan tiap strip
ke dalam media sesuai (lihat Media di bawah Uji
Sterilitas <71>) untuk merendam indikator biologi
dalam tabung yang sesuai. Untuk tiap Indikator Biologi
untuk Sterilisasi Uap Basah, Self-Contained spesimen,
strip kertas direndam dalam media self-contained
menurut petunjuk pabrik, dalam catatan waktu tidak
lebih dari 4 jam. Inkubasi tiap tabung pada suhu rekoveri
optimal yang ditetapkan pabrik. Amati tiap tabung berisi
media yang diinokulasi pada interval yang cukup untuk
total 7 hari sesudah inokulasi. (Bila terjadi pertumbuhan
pada saat pengamatan maka inkubasi tidak perlu
dilanjutkan). Catat jumlah spesimen yang tidak tumbuh
pada tiap waktu.
Untuk Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap Basah,
Pemanasan Kering, dan Sterilisasi Gas, Pembawa
Bukan kertas, rekoveri spora dari pembawa indikator
biologi akan mengikuti procedure yang dijelaskan dalam
procedure Angka Total Spora Hidup. Metode penetapan
nilai-D indikator biologi dengan pembawa kertas dapat
dipakai untuk menghitung nilai-D untuk pembawa
bukan kertas. Kondisi inkubasi mikroba yang akan
dipakai untuk indikator biologi dengan pembawa
bukan kertas dijelaskan dalam bab Angka Total Spora
Hidup.
Untuk Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap Basah,
Pemanasan Kering, dan Gas, Suspensi Spora Cair,
metode rekoveri sesudah kondisi pemaparan sterilisasi
yaitu metode yang dijelaskan dalam bab Angka Total
Spora Hidup suspensi spora cair, dan jika penetapan
nilai-D pemanasan kering dibuat dari suspensi B.
atrophaeus, procedure rekoveri sama seperti dijelaskan
dalam Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap Basah
dengan Pembawa Kertas.
Ketika dipakai Clostridium spo
.jpg)
