trium klorida P 0,9% sampai diperoleh suspensi
padatan darah lebih kurang 10%. Campur 1 tetes
suspensi ini dengan volume sama pereaksi anti IgG
manusia yang sesuai dengan pengenceran yang sesuai
pada pelat tetes. Goyang pelat tetes perlahan-lahan,
amati reaksi positif berupa aglutinasi yang timbul sesudah
5 menit (sesudah waktu ini , besar kemungkinan
terbentuk aglutinasi tidak khas). Dengan cara lain, cuci
sel uji dan sel kontrol dengan larutan natrium klorida P
0,9% secara manual atau dengan alat mekanik otomatis,
dan lalu tambahkan beberapa volume yang sesuai
- 1389 -
pereaksi anti IgG manusia dengan pengenceran yang
sesuai. sesudah disentrifus amati aglutinasi berupa
endapan sel darah merah.
Uji otomatis Lakukan dengan cara seperti tertera
pada Penetapan Golongan Darah ABO Donor <101>,
memakai Pereaksi golongan darah Rh yang sesuai
sebagai pengganti pereaksi golongan darah ABO.
Uji Antigen C dan E Darah donor yang diuji dengan
cara di atas menampilkan negatif-D, harus diuji lagi
terhadap antigen C dan E. Hanya darah donor yang
negatif terhadap ketiga antigen dianggap sebagai negatif
Rh (rr). Uji terhadap antigen C dan E dilakukan seperti
pada Uji Antigen-D memakai pereaksi golongan
darah Rh anti-C atau anti-E yang sesuai. Dalam sistem
otomatis, contoh darah biasanya diuji terhadap ketiga
antigen secara simultan.
Pereaksi golongan darah Rh Pereaksi golongan
darah Rh dipilih atas dasar kesesuaian pemakaian
dalam uji manual. Jika pereaksi ini akan dipakai
dalam uji otomatis, kesesuaian pereaksi harus dikaji
dengan melakukan uji otomatis memakai beberapa
besar suspensi sel darah merah yang mencakup fenotipe
Rh dari berbagai variasi.
Pereaksi golongan darah anti-D, pereaksi golongan
darah anti-D, IgM, mudah dipakai tapi tidak selalu
terpercaya. Pereaksi golongan darah anti-D, IgG, lebih
banyak tersedia dan lebih umum dipakai .
Pereaksi golongan darah Rh dibuat dari sera atau
plasma didefibrinasi dari satu orang atau lebih yang
diimunisasi dengan antigen yang sesuai dari sistem Rh
atau dari biakan limfosit mamalia. Hanya bahan yang
telah diuji negatif terhadap antigen permukaan Hepatitis
B dengan metode peka dapat dipakai . Pereaksi
golongan darah Rh dapat berupa cairan atau hasil
rekonstitusi pereaksi kering.
Pereaksi cair jernih atau sedikit opalesen, kekuningan
atau cairan tidak berwarna tanpa kekeruhan, dapat
mengandung bahan pengawet antimikroba yang sesuai.
Pereaksi kering berupa serbuk kuning pucat atau padatan
rapuh.
Pereaksi golongan darah Rh terdiri dari 4 tipe, yaitu
pereaksi golongan darah anti-D, IgM; pereaksi golongan
darah anti-D, IgG; pereaksi golongan darah Anti-C; dan
pereaksi golongan darah anti-E.
Pereaksi golongan darah anti-D, IgM,
mengaglutinasi suspensi sel positif-D dalam larutan
natrium klorida P 0,9%. Pereaksi harus tidak
menampilkan aglutinasi dalam kondisi seperti tertera
pada pemakaian untuk tiap kumpulan sel yang lengkap
yang tidak mengandung antigen D dan yang dipilih
sebagai antigen sel darah merah dengan rentang luas.
Pereaksi golongan darah anti-D, IgG, mengaglutinasi
sel darah merah manusia positif-D dalam larutan
albumin serum sapi P 20% - 30%. Pereaksi ini juga
melapisi suspensi sel darah merah manusia positif-D
dalam larutan natrium klorida P 0,9% sampai sel ini
kemungkinan dapat diaglutinasi dengan pereaksi
antiglobulin anti-IgG. Dengan modifikasi kimia IgG,
pereaksi golongan darah anti-B, IgG, dapat
mengaglutinasi suspensi sel darah merah manusia
positif-D dalam larutan natrium klorida-P 0,9%.
Pereaksi harus tidak menampilkan aglutinasi atau
melapisi, dalam kondisi seperti tertera pada pemakaian ,
untuk tiap kumpulan sel yang lengkap yang tidak
mengandung antigen D dan yang dipilih sebagai antigen
sel darah merah dengan rentang luas.
Pereaksi golongan darah anti-C mengandung
terutama IgM, atau IgG, antibodi anti-C. Lakukan uji
yang sesuai terhadap kelas imunologis antibodi yang ada
(masing-masing seperti tertera pada pereaksi golongan
darah anti-D, IgM, dan pereaksi golongan darah anti-D,
IgG).
Untuk mendeteksi antigen C dalam donor negatif D;
anti C, D (yaitu anti-G) dapat dipakai . Aktivitas anti-
C harus dapat bereaksi dengan antigen Cw jika dalam
kombinasi, Cw/c. Anti-G yang bereaksi dengan antigen C
atau D, atau kedua antigen C dan D, jika ada tidak
mempengaruhi sediaan yang negatif-DE. Dengan cara
lain pereaksi anti-C dapat dipakai , dibuat dari donor
negatif-C, positif-D, E.
Anti-C harus dapat mendeteksi antigen Cw jika dalam
kombinasi Cw/c, dan dapat mendeteksi C dalam posisi
sis dengan e dan E (Ce, CE). Pereaksi ini kurang dapat
bereaksi dengan kompleks CE (CDE, CdE). Pereaksi
golongan darah Anti-C tidak boleh menampilkan
aglutinasi, dalam kondisi seperti tertera pada
pemakaian , untuk tiap kumpulan sel yang lengkap yang
tidak mengandung antigen C atau Cw (atau antigen D
dalam anti-G) yang dipilih sebagai antigen sel darah
merah dengan rentang luas meliputi A, B dan E.
Pereaksi golongan darah anti-E dapat mengandung
terutama IgM atau IgG, antibodi anti-E dan lakukan uji
yang sesuai terhadap kelas imunologis antibodi yang ada
(masing-masing seperti tertera pada pereaksi golongan
darah anti-D, IgM, dan pereaksi golongan darah anti-D,
IgM, dan pereaksi golongan darah anti-D, IgG).
Banyak contoh pereaksi anti-E mengandung
beberapa anti-cE, antibodi Rh yang mengaglutinasi
hanya sel darah merah manusia dengan antigen c dan E
dinyatakan dengan gen c dan E yang ada dalam
kompleks gen Rh yang sama, yaitu posisi cis, dan yang
tidak mengaglutinasi sel yang mengandung antigen E
yang dinyatakan dari kompleks gen seperti CDE dan
CdE yang tidak mengandung e. Pereaksi golongan darah
anti-E harus menampilkan aglutinasi terhadap sel darah
merah harus yang mengandung antigen E yang tidak
menampilkan kompleks gen yang juga mengandung e.
Pereaksi tidak boleh menampilkan aglutinasi, dalam
kondisi seperti tertera pada pemakaian , tiap kumpulan
sel yang lengkap yang dipilih sebagai antigen sel darah
merah dengan rentang luas. Kemungkinan lain dapat
dipakai pereaksi anti-D, E.
Pereaksi golongan darah Rh, jika perlu direkonstitusi
seperti tertera pada etiket, memenuhi persyaratan
berikut.
POTENSI
Pereaksi golongan darah anti-D, IgM Mengandung
anti-D sebagai aglutinin salin dalam jumlah yang
memberi reaksi positif pada pengenceran 1 dalam 32
- 1390 -
terhadap sel darah merah yang diketahui mengandung
antigen D.
Pereaksi golongan darah anti-D, IgG Potensi
pereaksi golongan darah anti-D, IgG, ditetapkan dengan
membandingkan aktivitas antibodi aglutinin albumin
dengan Serum Golongan Darah BPFI yang sesuai atau
dengan baku lain yang sesuai yang telah dibakukan
terhadap Serum Golongan Darah BPFI.
Lakukan penetapan titrasi pereaksi uji bersama
dengan sediaan baku terhadap suspensi sel darah
manusia yang mengandung antigen D.
Pereaksi golongan darah anti-D, IgG, mengandung
tidak kurang dari 32 unit antibodi anti-D per ml, titer
pereaksi yang diuji tidak kurang dari setengah dari titer
Serum Golongan Darah Tidak Lengkap Anti-Rh0 (anti-
D) Manusia BPFI (mengandung 32 unit).
Pereaksi golongan darah anti-C Mengandung
antibodi anti-C dalam jumlah tertentu yang dapat
memberi reaksi positif terhadap sel darah merah
yang diketahui mengandung antigen C pada pengenceran
1 dalam 8.
Pereaksi golongan darah anti-E Mengandung
antibodi anti-E dalam jumlah tertentu yang dapat
memberi reaksi positif terhadap sel darah merah
yang diketahui mengandung antigen E pada pengenceran
1 dalam 8.
Sterilitas <71> Memenuhi syarat.
Wadah dan penyimpanan Dalam wadah steril
tertutup kedap.
Sediaan dalam bentuk cair yang tidak mengandung
pengawet antimikroba disimpan dalam keadaan beku
sebaiknya pada suhu di bawah -30º.
Sediaan bentuk cair yang mengandung pengawet
antimikroba disimpan pada suhu 2º sampai 8º, hindari
pembekuan kecuali bila pengawet ini tidak merusak
pereaksi dalam keadaan beku.
Sediaan kering disimpan pada suhu tidak lebih dari
20º.
PENETAPAN KADAR KALSIUM
PANTOTENAT <121>
Baku Pembanding Kalsium Pantotenat BPFI;
lakukan pengeringan pada suhu 105º selama 3 jam
sebelum dipakai . Simpan dalam wadah tertutup rapat.
Larutan baku persediaan Timbang saksama lebih
kurang 50 mg Kalsium Pantotenat BPFI yang telah
dikeringkan dan disimpan di tempat gelap, diatas fosfor
pentoksida P, hindari penyerapan uap air selama
penimbangan. Larutkan dengan lebih kurang 500 ml air
dalam labu tentukur 1000-ml. Tambahkan 10 ml asam
asetat 0,2 N dan 100 ml larutan natrium asetat P (1
dalam 60), encerkan dengan air sampai tanda. Tiap ml
larutan setara dengan 50 μg Kalsium Pantotenat BPFI.
Simpan di bawah lapisan toluen P dalam lemari
pendingin.
Larutan baku Pada hari pengujian, encerkan
beberapa Larutan baku persediaan yang diukur saksama
dengan air sampai kadar antara 0,01 μg dan 0,04 μg
kalsium pantotenat per ml, pakailah kadar yang tepat
sampai respons yang diperoleh seperti tertera pada
procedure , 2,0 ml dan 4,0 ml Larutan baku yang
dipakai , berada dalam garis lurus kurva respons log-
kadar.
Larutan uji Buat larutan seperti tertera pada masing-
masing monografi dengan kadar setara kalsium
pantotenat dalam Larutan baku.
Larutan persediaan media basal
Larutan kasein terhidrolisa asam
Larutan Sistin Triptofan
Larutan polisorbat 80
Dekstrosa anhidrat
Natrium asetat anhidrat
Larutan Adenin-Guanin-Urasil
Larutan Riboflavin-Tiamin Hidroklorida
-Biotin
Larutan asam para-aminobenzoat-Niasin
-Piridoksin Hidrolrorida
Larutan garam A
Larutan garam B
25 ml
25 ml
0,25 ml
10 g
5 g
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
Larutkan dekstrosa anhidrat dan natrium asetat dalam
larutan yang dicampur terdahulu, atur pH 6,8 dengan
penambahan natrium hidroksida 1 N, encerkan dengan
air sampai 250 ml.
Larutan kasein terhidrolisis asam Campur 100 g
kasein P bebas vitamin dengan 500 ml asam klorida 6 N
dan refluks campuran selama 8 - 12 jam. Hilangkan
asam klorida dalam campuran dengan penyulingan pada
tekanan rendah sampai sisa berbentuk pasta kental.
Larutkan kembali pasta yang terbentuk dengan air, atur
pH 3,5±0,1 dengan natrium hidroksida 1 N dan
tambahkan air sampai 1000 ml. Tambahkan 20 g arang
aktif P, aduk selama 1 jam dan saring. Ulangi perlakuan
dengan arang aktif. Simpan di bawah toluen P dalam
lemari pendingin pada suhu tidak kurang dari 10º. Saring
larutan jika pada waktu penyimpanan terbentuk endapan.
Larutan sistin-triptofan Suspensikan 4,0 g L-sistin P
dan 1,0 g L-triptofan P (atau 2,0 g D,L-triptofan) dalam
700 - 800 ml air, panaskan pada suhu 70º sampai 80º dan
tambahkan larutan asam klorida P (1 dalam 2) tetes
demi tetes dengan pengadukan sampai padatan larut.
Simpan di bawah toluen P dalam lemari pendingin pada
suhu tidak kurang dari 10º.
Larutan adenin-guanin-urasil Larutkan dengan
pemanasan adenin sulfat P, guanin hidroklorida P dan
urasil P masing-masing 200 mg dalam 10 ml asam
klorida 4 N, dinginkan dan tambahkan air sampai 200
ml. Simpan di bawah lapisan toluen dalam lemari
pendingin.
- 1391 -
Larutan polisorbat 80 Larutkan 25 g polisorbat 80 P
dalam etanol P sampai 250 ml.
Larutan riboflavin-tiamin hidroklorida-biotin Buat
larutan dalam asam asetat 0,02 N sampai tiap ml
mengandung masing-masing 20 μg riboflavin P, 10 μg
tiamin hidroklorida P dan 0,04 μg biotin P. Simpan di
bawah lapisan toluen dalam lemari pendingin.
Larutan asam para aminobenzoat-niasin-
piridoksin hidroklorida Buat larutan dalam etanol P
25% netral sampai tiap ml mengandung 10 μg asam p-
aminobenzoat P, 50 μg niasin P dan 40 μg piridoksin
hidroklorida P. Simpan dalam lemari pendingin.
Larutan garam A Larutkan 25 g kalium fosfat
monobasa P dan 25 g kalium fosfat dibasa P dalam air
sampai 500 ml. Tambahkan 5 tetes asam klorida P,
simpan di bawah lapisan toluen.
Larutan garam B Larutkan 10 g magnesium sulfat P
dan 500 mg natrium klorida P, 500 mg besi(II) sulfat P
dan 500 mg mangan sulfat P dalam air sampai 500 ml.
Tambahkan 5 tetes asam klorida P, simpan di bawah
lapisan toluen.
Biakan persediaan lactobacillus plantarum
Larutkan 2,0 g ekstrak ragi P larut air dalam 100 ml air,
tambahkan 500 mg dekstrosa anhidrat P, 500 mg
natrium asetat anhidrat P dan 1,5 g agar P, panaskan
capuran di atas tangas uap sambil diaduk sampai agar
terlarut. Tuang masing-masing lebih kurang 10 ml
larutan agar panas ke dalam tabung reaksi, tutup tabung,
sterilkan pada suhu 121º, biarkan tabung mendingin
dalam posisi tegak. Buat biakan dari biakan murni
Lactobacillus plantarum dengan tusukan pada tiga atau
lebih tabung reaksi. Inkubasi selama 16 - 24 jam pada
suhu antara 30º dan 37 º ±0,5º lalu simpan dalam
lemari pendingin. Buat biakan segar dari biakan
persediaan setiap minggu dan tidak boleh dipakai
sebagai inokulum bila umur biakan lebih dari 1 minggu.
Media biakan Pada tiap seri tabung berisi 5,0 ml
Larutan persediaan media basal tambahkan 5,0 ml air
yang mengandung 0,2 μg kalsium pantotenat. Sumbat
tabung dengan kapas, sterilkan dengan otoklaf pada suhu
121º dan dinginkan.
Inokula Pindahkan sel dari Biakan persediaan
lactobacillus plantarum ke dalam tabung steril berisi 10
ml Media biakan. Inkubasi biakan selama 16 sampai 24
jam pada suhu yang dipilih antara 30º dan 37º±0,5º.
Suspensi sel yang diperoleh yaitu Inokula.
procedure Pada dua seri tabung reaksi ukuran sama
masukkan 1,0 ml dan/atau 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml
dan 5,0 ml Larutan baku. Pada tiap tabung dan 4 tabung
sejenis yang tidak berisi Larutan baku tambahkan 5,0 ml
Larutan persediaan media basal dan air secukupnya
sampai 10 ml. Pada dua seri tabung reaksi sejenis
masukkan beberapa Larutan uji setara dengan 3 atau
lebih tingkat kadar Larutan baku meliputi tingkat 2,0
ml; 3,0 ml dan 4,0 ml. Pada masing-masing tabung
tambahkan 5,0 ml Larutan persediaan media basal dan
air secukupnya sampai 10 ml. Tempatkan dua seri
tabung Larutan baku dan Larutan baku bersama-sama
dalam rak tabung dan sebaiknya tempatkan tabung
secara acak.
Tutup tabung untuk mencegah kontaminasi jasad
renik dan panaskan dalam otoklaf pada suhu 121º selama
5 menit. Dinginkan dan tambahkan 1 tetes inokula pada
tiap tabung kecuali 2 dari 4 tabung yang tidak berisi
Larutan baku (sebagai blangko yang tidak diinokulasi)
dan campur. Inokulasi tabung pada suhu antara 30º dan
37º ± 0,5º selama 16 - 24 jam, sampai tidak terbentuk
penambahan kekeruhan pada tabung yang mengandung
baku kadar tertinggi dalam waktu 2 jam.
Tentukan transmitans tabung denga cara sebagai
berikut: Campur isi tiap tabung, ukur transmitans pada
panjang gelombang antara 540 nm dan 660 nm, sesudah
tercapai keadaan stabil. Keadaan stabil dicapai beberapa
detik sesudah dikocok, bila pembacaan transmitans stabil
selama 30 detik atau lebih. pakailah interval waktu yang
relatif sama untuk setiap pembacaan tabung.
Atur transmitans 1,00 memakai blangko yang
tidak diinokulasi, ukur transmitans blangko terinokulasi.
Dengan transmitans 1,00 untuk blangko terinokulasi,
ukur transmitans tabung-tabung lain. Jika terjadi
kontaminasi dengan jasad renik asing, ulangi pengujian.
Perhitungan Buat kurva baku antar kadar dan
respons dengan cara sebagai berikut: Untuk tiap tingkat
kadar Larutan baku, hitung respons dari jumlah harga
duplikasi transmitans ( ) sebagai selisih, Y = 2,00 -
(dari transmitans). Gambarkan kurva dengan respons
pada ordinat kertas grafik terhadap log dari volume
Larutan baku dalam ml tiap tabung pada absis, untuk
ordinat memakai skala aritmetika atau logaritmik
sesampai diperoleh mendekati garis lurus. Gambar garis
lurus atau kurva yang paling sesuai dengan titik yang
diperoleh.
Hitung respons y dengan menambah bersama dua
transmitans untuk tiap kadar Larutan uji. Baca dari
kurva baku logaritma volume Larutan baku yang sesuai
untuk tiap harga y yang terletak pada rentang titik
terendah dan tertinggi dari baku. Kurangkan dari tiap
logaritma yang diperoleh, logaritma dari volume dalam
ml Larutan uji untuk memperoleh perbedaan, x, untuk
tiap tingkat dosis. Harga rata-rata x untuk masing-
masing tiga atau lebih tingkat dosis untuk memperoleh x
= M’, log-potensi relatif Larutan uji. Hitung jumlah
dalam mg Kalsium Pantotenat BPFI yang sesuai dengan
kalsium pantotenat dalam beberapa bahan yang
dipakai untuk pengujian sebagai antilog:
M = antilog (M’ + log R)
R yaitu jumlah mg kalsium pantotenat yang
diperkirakan ada dalam tiap mg (kapsul atau tablet) yang
dipakai untuk pengujian.
- 1392 -
Pengulangan Ulangi seluruh penetapan sekurang-
kurangnya satu kali, dengan Larutan uji yang dibuat
terpisah. Jika perbedaan antara dua log-potensi M tidak
lebih dari 0,08, harga rata-rata M yaitu log-potensi
sediaan uji seperti tertera pada Rentang dan batas
keyakinan dari potensi dalam Desain analisa Penetapan
Hayati <81>. Jika dua penetapan berbeda lebih dari
0,008 lakukan satu atau lebih penetapan tambahan. Dari
harga rata-rata dua atau lebih harga M yang tidak
berbeda lebih dari 0,15, hitung potensi rata-rata Larutan uji.
PENETAPAN POTENSI ANTIBIOTIK
SECARA MIKROBIOLOGI <131>
Aktivitas (potensi) antibiotik dapat ditunjukkan pada
kondisi yang sesuai dengan efek daya hambatnya
terhadap mikroba. Penurunan aktivitas antimikroba tidak
dapat ditunjukkan oleh metode kimia, sesampai
pengujian secara mikrobiologi atau biologi merupakan
standar dalam penetapan penurunan aktivitas anti
mikroba. Bab ini mencakup cara kerja penetapan
antibiotik yang tercantum dalam Farmakope ini, dengan
pengujian secara mikrobiologi.
Ada dua metode umum yang dapat dipakai , yaitu
penetapan dengan lempeng-silinder atau “cawan” dan
penetapan dengan cara “tabung” atau turbidimetri.
Metode pertama berdasarkan difusi antibiotik dari
silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar
padat dalam cawan Petri atau cawan, sesampai mikroba
yang ditambahkan dihambat pertumbuhannya pada
daerah berupa lingkaran atau “zona” di sekeliling
silinder yang berisi larutan antibiotik. Metode
turbidimetri berdasarkan atas hambatan pertumbuhan
biakan mikroba dalam larutan serba sama antibiotik,
dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroba
dengan cepat bila tidak ada antibiotik.
PERALATAN
Semua peralatan harus dicuci bersih sebelum dan
sesudah dipakai . Peralatan gelas untuk menyimpan
dan memindahkan mikroba uji, disterilkan dengan
pemanasan kering atau dengan uap air.
Pengendalian Suhu
Pengendalian termostatik diperlukan dalam beberapa
tahap penetapan secara mikrobiologi, waktu
membiakkan mikroba dan penyiapan inokulanya, selama
inkubasi dalam penetapan pada cawan dan tabung. Suhu
pada penetapan dengan cara cawan dipertahankan pada
lebih kurang 0,5° dari suhu yang dipilih. Pengendalian
suhu yang lebih dekat (lebih kurang 0,1° dari suhu yang
dipilih) sangat penting untuk inkubasi pada penetapan
dengan cara tabung, hal ini dapat diperoleh dengan
sirkulasi udara atau air, kapasitas panas dari air yang
lebih besar lebih menguntungkan daripada sirkulasi
udara.
Spektrofotometer
Pengukuran transmitans dalam pita frekuensi yang
sempit, membutuhkan spektrofotometer yang sesuai dan
memiliki sumber cahaya panjang gelombang yang
dapat diubah atau dibatasi memakai filter 580 nm
untuk penyiapan inokula dengan kerapatan tertentu, atau
dengan filter 530 nm untuk pengukuran serapan pada
pengujian dengan cara tabung. Untuk tujuan yang
disebut terakhir, alat dapat diatur sampai dapat menerima
tabung yang dipakai untuk inkubasi (lihat Wadah
untuk Penetapan Secara Turbidimetri) dan
memakai sel yang dimodifikasi yang dilengkapi
dengan pipa pembuangan untuk memudahkan
pertukaran isi dengan cepat, atau lebih disukai sel yang
memiliki saluran untuk pengaliran secara sinambung
selama pengukuran. Atur serapan dengan blangko untuk
serapan nol memakai media cair yang jernih tanpa
inokula yang disiapkan seperti dinyatakan untuk masing-
masing antibiotik, termasuk beberapa yang sama larutan
uji dan formaldehida dalam tiap sampel. [Catatan
Pengukuran serapan atau tranmitans dapat dipakai
untuk penyiapan inokula.]
Wadah untuk Penetapan secara Lempeng-Silinder
Untuk penetapan cara lempeng, pakailah cawan Petri
kaca atau plastik (lebih kurang 100 mm x 20 mm) yang
memiliki tutup dari bahan yang sesuai. Untuk silinder,
pakailah silinder besi tahan karat atau porselen dengan
toleransi ukuran masing-masing lebih kurang 0,1 mm:
diameter luar 8 mm, diameter dalam 6 mm, dan tinggi
10 mm. Cuci silinder dengan saksama untuk
membersihkan semua residu, kadang-kadang diperlukan
suatu asam seperti asam nitrat 2 N atau asam kromat
seperti tertera pada Pencucian Peralatan Kaca <1331>.
Wadah untuk Penetapan secara Turbidimetri
Untuk penetapan dengan cara tabung, pakailah tabung
reaksi kaca atau plastik dengan ukuran misalnya 125 x
16 mm atau 150 x 18 mm yang panjang, diameter dan
ketebalannya relatif seragam serta permukaannya tidak
cacat dan tidak tergores. Tabung yang akan ditempatkan
pada spektrofotometer harus yang sesuai, tanpa goresan
dan tidak cacat. Bersihkan saksama tabung dari semua
residu antibiotik dan sisa larutan pembersih, dan
sterilkan sebelum dipakai untuk penetapan
berikutnya.
MEDIA DAN PENGENCER
Media
Media yang diperlukan untuk penyiapan inokula
mikroba uji dibuat dari bahan-bahan yang tertera di
bawah ini. Sedikit modifikasi dari masing-masing bahan,
atau media kering yang direkonstitusi, dapat dilakukan
dengan syarat media yang dihasilkan memiliki daya
- 1393 -
menumbuhkan yang sama atau lebih baik dan
memberi respons kurva baku yang sama.
Larutkan bahan-bahan dalam air sampai 1 liter, dan
atur pH larutan memakai natrium hidroksida 1 N
atau asam klorida 1 N, sampai sesudah sterilisasi uap air
pH media sesuai dengan yang tertera.
MEDIA 1
Pepton P 6,0 g
Digesti pankreatik kasein 4,0 g
Ekstrak ragi P 3,0 g
Ekstrak daging P 1,0 g
Dekstrosa P 1,0 g
Air 15,0 g
Air 1000 ml
pH sesudah sterilisasi 6,6±0,1
MEDIA 2
Pepton P 6,0 g
Ekstrak ragi P 3,0 g
Ekstrak daging P 1,5 g
Agar P 15,0 g
Air 1000 ml
pH sesudah sterilisasi 6,6±0,1
MEDIA 3
Pepton P 5,0 g
Ekstrak ragi P 1,5 g
Ekstrak daging P 1,5 g
Natrium klorida P 3,5 g
Dekstrosa P 1,0 g
Kalium fosfat dibasa P 3,68 g
Kalium fosfat monobasa P 1,32 g
Air 1000 ml
pH sesudah sterilisasi 7,0±0,05
MEDIA 4
Sama seperti Media 2, kecuali tambahkan 1,0 g
Dekstrosa P.
MEDIA 5
Sama seperti Media 2, kecuali pH sesudah sterilisasi
7,9 ±0,1.
MEDIA 8
Sama seperti Media 2, kecuali pH sesudah sterilisasi
5,9 ±0,1.
MEDIA 9
Digesti pankreatik kasein P 17,0 g
Digesti papaik kedele P 3,0 g
Natrium klorida P 5,0 g
Kalium fosfat dibasa P 2,5 g
Dekstrosa P 2,5 g
Agar P 20,0 g
Air 1000 ml
pH sesudah sterilisasi 7,2 ± 0,1
MEDIA 10
Sama seperti Media 9, kecuali memakai agar P
12,0 g sebagai ganti 20,0 g, dan sesudah pendidihan
media untuk melarutkan agar, tambahkan 10 ml
polisorbat 80 P. pH sesudah sterilisasi 7,2±0,1.
MEDIA 11
Sama seperti Media 1 kecuali pH sesudah sterilisasi
8,3±0,1.
MEDIA 13
Dekstrosa P 20,0 g
Pepton P 10,0 g
Air 1000 ml
pH sesudah sterilisasi 5,6±0,1
MEDIA 19
Pepton P 9,4 g
Ekstrak ragi P 4,7 g
Ekstrak daging P 2,4 g
Natrium klorida P 10,0 g
Dekstrosa P 10,0 g
Agar P 23,5 g
Air 1000 ml
pH sesudah sterilisasi 6,1±0,1
MEDIA 32
Sama seperti Media 1 kecuali tambahkan 300 mg
mangan sulfat P.
MEDIA 34
Gliserin P 10,0 g
Pepton P 10,0 g
Ekstrak daging P 10,0 g
Natrium klorida P 3,0 g
Air 1000 ml
pH sesudah sterilisasi 7,0±0,1
MEDIA 35
Sama seperti Media 3, kecuali tambahkan 17,0 g agar P.
MEDIA 36
Digesti pankreatik kasein P 15,0 g
Digesti papaik kedele P 5,0 g
Natrium klorida P 5,0 g
Agar P 15,0 g
Air 1000 ml
pH sesudah sterilisasi 7,3 ± 0,1
- 1394 -
MEDIA 39
Sama seperti Media 3, kecuali pH sesudah sterilisasi
7,9±0,1.
MEDIA 40
Ekstrak ragi P 20,0 g
Polipepton P 5,0 g
Dekstrosa P 10,0 g
Kalium fosfat monobasa P 2,0 g
Polisorbat 80 P 0,1 g
Agar P 10,0 g
Air 1000 ml
pH sesudah sterilisasi 6,7±0,2.
MEDIA 41
Digesti pankreatik kasein P 9,0 g
Dekstrosa P 20,0 g
Ekstrak ragi P 5,0 g
Natrium sitrat P 10,0 g
Kalium fosfat monobasa P 1,0 g
Kalium fosfat dibasa P 1,0 g
Air 1000 ml
pH sesudah sterilisasi 6,8±0,1
Dapar Fosfat Dan Larutan Lain
Buat seperti di bawah ini atau dengan cara lain yang
sesuai, dapar fosfat yang diperlukan untuk antibiotik
yang ditetapkan. Dapar disterilkan sesudah pembuatan
dan pH yang tertera pada masing-masing yaitu pH
sesudah sterilisasi.
Dapar Nomor 1; 1%; pH 6,0. Larutkan 2,0 g kalium
fosfat dibasa P dan 8,0 g kalium fosfat monobasa P
dalam 1000 ml air. Atur pH sampai 6,0±0,05 dengan
asam fosfat 18 N atau kalium hidroksida 10 N.
Dapar Nomor 3; 0,1 M; pH 8,0 Larutkan 16,73 g
kalium fosfat dibasa P dan 0,523 g kalium fosfat
monobasa P dalam air 1000 ml. Atur pH sampai
8,0±0,1 dengan asam fosfat 18 N atau kalium hidroksida
10 N.
Dapar Nomor 4; 0,1 M; pH 4,5 Larutkan 13,61 g
kalium fosfat monobasa P dalam 1000 ml air. Atur pH
sampai 4,5±0,05 dengan asam fosfat 18 N atau natrium
hidroksida 10 N.
Dapar Nomor 6; 10%; pH 6,0 Larutkan 20,0 g kalium
fosfat dibasa P dan 80,0 g kalium fosfat monobasa P
dalam 1000 ml air. Atur pH sampai 6,0±0,05 dengan asam
fosfat 18 N atau natrium hidroksida 10 N.
Dapar Nomor 10; 0,2 M; pH 10,5 Larutkan 35,0 g
kalium fosfat dibasa P dalam 1000 ml air dan tambahkan
2 ml kalium hidroksida 10 N. Atur pH sampai 10,5±0,1
dengan asam fosfat 18 N atau kalium hidroksida 10 N.
Dapar Nomor 16; 0,1 M; pH 7,0 Larutkan 13,6 g
kalium fosfat dibasa P dan 4,0 g kalium fosfat monobasa
P dalam 1000 ml air. Atur pH sampai 7,0±0,2 dengan
asam fosfat 18 N atau natrium hidroksida 10 N.
Larutan Lain pakailah bahan-bahan tertera pada
Pereaksi, Indikator dan Larutan. Untuk air, pakailah Air
Murni; untuk natrium klorida pakailah Injeksi Natrium
Klorida; untuk formaldehida encer yaitu Larutan
Formaldehida yang diencerkan dengan air 1:3.
UNIT DAN BAKU PEMBANDING
Potensi antibiotik dinyatakan dalam “unit” atau “ g”
aktivitas. Pada biasanya “unit” atau “ g” aktivitas
antibiotik. Baku Pembanding Farmakope negara kita
(BPFI) dikalibrasi terhadap baku primer antibiotik yang
bersangkutan. Antibiotik BPFI dibuat dan diedarkan oleh
instansi yang berwenang.
Pengertian ” g” aktivitas berasal dari sediaan antibiotik
yang dipilih sebagai baku pembanding yang dianggap
secara keseluruhan terdiri dari bahan kimia tunggal, dan
oleh sebab itu dinyatakan potensi 1000 “ g” per mg.
Dalam beberapa hal, sebagai hasil pengembangan
metode pembuatan dan pemurnian antibiotik tertentu,
aktivitas sediaan dapat lebih dari 1000 “ g” per mg.
sebab nya dapat dimengerti bahwa sediaan yang
demikian memiliki aktivitas yang setara dengan
jumlah tertentu “ g” baku pembanding asli. namun pada
biasanya “ g” aktivitas yaitu tepat setara secara
numerik dengan g (bobot) sediaan murni. Kesulitan
timbul pada beberapa keadaan seperti jika antibiotik
terdiri dari bentuk basa bebas dan garamnya, dan “ g”
aktivitas dinyatakan untuk salah satu dari bentuk
ini ; bahan antibiotik terdiri dari beberapa
komponen yang memiliki sifat kimia yang sangat
mirip namun memiliki aktivitas antibiotik yang
berbeda; atau potensi dari satu kelompok antibiotik
dinyatakan dengan baku pembanding yang merupakan
salah satu antibiotik anggotanya, namun sediaan itu
sendiri dapat tidak serba sama (heterogen). Dalam hal ini
“ g” aktivitas dinyatakan dalam “unit”. “ g” aktivitas
harus tidak dianggap sama dengan g (bobot) dari bahan
antibiotik.
PENYIAPAN BAKU
Untuk menyiapkan larutan persediaan, larutkan
beberapa baku pembanding antibiotik yang ditimbang
saksama dan sebelumnya telah dikeringkan seperti
tertera pada Tabel 1, atau seluruh isi satu vial, jika
diperlukan, dalam pelarut seperti tertera pada tabel
ini , lalu encerkan sampai kadar yang
dikehendaki. Simpan dalam lemari pendingin dan
pakailah dalam waktu yang ditentukan. Pada hari
penetapan, buat pengenceran dari larutan persediaan
5 atau lebih larutan untuk pengujian dengan kadar
bertahap, biasanya dengan perbandingan 1:1,25 untuk
penetapan dengan procedure Lempeng-Silinder atau lebih
kecil untuk penetapan turbidimetri. pakailah pengencer
akhir yang dinyatakan dan urutan kadar dengan dosis
tengah yang ditentukan.
- 1395 -
TABEL 1
PENYIAPAN LARUTAN PEMBANDING PERSEDIAAN DAN PENGENCERANNYA
Antibiotik dan cara
penetapan [Cara Lempeng
(CL) atau turbidimetri (T)]
Larutan persediaan Enceran uji
Pelarut awal (Kadar awal yang
ditetapkan sebelumnya) [pengencer
selanjutnya bila berbeda]
Kadar
persediaan
akhir per ml
Batas waktu
pemakaian
Pengencer akhir Dosis tengah
( g aktivitas
atau unit per ml)
Amfoterisin B (CL) Dimetil sulfoksida 1 mg hari yang sama D.10 1,0 g
Amikasin (T) Air 1 mg 14 hari Air 10 g
Bleomisin (CL) D.16 2 U 14 hari D.16 0,04 U
Demeklosiklin (T) Asam klorida 0,1 N 1 mg 4 hari Air 0,1 g
Dihidrostreptomisin (CL) D.3 1 mg 30 hari D.3 1,0 g
Dihidrostreptomisin (T) Air 1 mg 30 hari Air 30 g
Doksisiklin (T) Asam klorida 0,1 N 1 mg 5 hari Air 0,1 g
Eritromisin (CL) Metanol (10 mg/ml); [D.3] 1 mg 14 hari D.3 1,0 g
Gentamisin (CL) D.3 1 mg 30 hari D.3 0,1 g
Gramisidin (T) Alkohol 95% 1 mg 30 hari Alkohol 95% 0,04 g
Kanamisin (T) Air 1 mg 30 hari Air 10 g
Kandisidin (T) Dimetilsulfoksida 1 mg hari yang sama Air 0,06 g
Kapreomisin (T) Air 1 mg 7 hari Air 100 g
Karbenisilin (CL) D.1 1 mg 14 hari D.1 20 g
Kloksasilin (CL) D.1 1 mg 7 hari D.1 5,0 g
Kloramfenikol (T) Alkohol (10 mg/ml); [Air] 1 mg 30 hari Air 2,5 g
Klortetrasiklin (T) Asam klorida 0,01 N 1 mg 4 hari Air 0,06 g
Kolistin (CL) Air (10 mg/ml);[D. 6] 1 mg 14 hari D.6 1,0 g
Metasiklin (T) Air 1 mg 7 hari Air 0,06 g
Nafsilin (CL) D.1 1 mg 2 hari D.1 2,0 g
Natamisin (CL) Dimetil sulfoksida 1 mg hari yang sama D.10 5,0 g
Natrium kolistimetat (CL) Air (10 mg/ml); [D.6] 1 mg hari yang sama D.6 1,0 g
Neomisin (CL) D.3 1 mg 14 hari D.3 1,0 g
Neomisin (T) D.3 100 g 14 hari D.3 1,0 g
Netilmisin (CL) D.3 1 mg 7 hari D.3 0,1 g
Nistatin (CL) Dimetilformamida 1000 U hari yang sama D.6 20 U
Novobiosin (CL) Alkohol (10 mg/ml); [D.3] 1 mg 5 hari D.6 0,5 g
Oksitetrasiklin (T) Asam klorida 0,1 N 1 mg 4 hari Air 0,24 g
Paromomisin (CL) D.3 1 mg 21 hari D.3 1,0 g
Penisilin G (CL) D.1 1000 U 4 hari D.1 1,0 g
Polimiksin B (CL) Air; [D.6] 10.000 U 14 hari D.6 10 U
Rolitetrasiklin (T) Air 1 mg 1 hari Air 0,24 g
Sefalotin (CL) D.1 1 mg 5 hari D.1 1,0 g
Sefapirin (CL) D.1 1 mg 3 hari D.1 1,0 g
Sikloserin (T) Air 1 mg 30 hari Air 50 g
Sisomisin (CL) D.3 1 mg 14 hari D.3 0,1 g
Streptomisin (T) Air 1 mg 30 hari Air 30 g
Tetrasiklin T) Asam klorida 0,1 N 1 mg 1 hari Air 0,24 g
Tikarsilin (CL) D.1 1 mg 1 hari D.1 5,0 g
Tiostrepton (T) Dimetilsulfoksida 1 U hari yang sama Dimetil sulfoksida 0,80 U
Tobramisin (T) Air 1 mg 14 hari Air 2,5 g
Troleandomisin (T) Isopropil alkohol – air (4:1) 1 mg hari yang sama Air 25 g
Tilosin (T) Metanol (10 mg/ml); [D.16] 1 mg 30 hari D.3:Metanol (1:1) 4 g
Vankomisin (CL) Air 1 mg 7 hari D.4 10 g
Zink Basitrasin (CL) Asam klorida 0,01 N 100 U hari yang sama D.1 1,0 U
Catatan: “D” menyatakan “dapar” diikuti nomor sesuai dengan yang tertera pada dapar kalium fosfat.
Untuk amfoterisin B, natrium kolistimetat dan nistatin, buat larutan baku pembanding dan larutan uji secara bersamaan.
Untuk amfoterisin B, encerkan selanjutnya larutan persediaan dengan dimetil sulfoksida P sampai diperoleh kadar 12,8; 16; 20; 25 dan 31,2 g
per ml pada saat menjelang membuat larutan uji. Enceran larutan uji harus mengandung beberapa yang sama dimetil sulfoksida P seperti pada
enceran larutan baku pembanding.
Untuk zink basitrasin, tiap enceran Larutan Baku harus mengandung asam klorida P beberapa sama dengan Enceran larutan uji.
Untuk neomisin yang ditetapkan dengan cara Turbidimetri, encerkan secara kuantitatif Larutan persediaan 100 g per ml dengan Dapar nomor
3 sampai diperoleh larutan dengan kadar setara 25,0 g per ml. Ke dalam labu tentukur 50 ml yang terpisah, masukkan masing-masing 1,39;
1,67; 2,00; 2,40; dan 2,88 ml larutan ini, tambahkan 5,0 ml asam klorida 0,01 N pada tiap labu dan encerkan dengan Dapar nomor 3 sampai
tanda, sampai diperoleh kadar neomisin larutan 0,69; 0,83; 1,0; 1,2; 1,44 g per ml. pakailah larutan ini untuk membuat garis respons baku.
Untuk Nistatin, encerkan selanjutnya larutan persediaan dengan dimetil formamida sampai diperoleh kadar 256 unit, 320 unit, 400 unit, 500 unit
dan 624 unit per ml pada saat menjelang membuat pengenceran Larutan uji. Buat Larutan baku untuk garis respons bersamaan dengan
pengenceran larutan uji. Enceran larutan uji harus mengandung beberapa yang sama dimetilformamida seperti pada larutan baku. pakailah
peralatan kaca aktinik rendah warna merah.
Untuk Polimiksin B, buat larutan persediaan dengan menambahkan 2 ml air untuk tiap 5 mg bahan baku pembanding.
- 1396 -
TABEL 2
MIKROBA UJI UNTUK PENETAPAN ANTIBIOTIK DENGAN procedure SEPERTI
TERTERA PADA TABEL 1
Antibiotik Mikroba uji Nomor ATCC
Amfoterisin B Saccharomyces cerevisiae 9763
Amikasin Staphylococcus aureus 29737
Basitrasin Micrococcus luteus 10240
Bleomisin Mycobacterium smegmatis 607
Demeklosiklin Staphylococcus aureus 29737
Dihidrostreptomisin (CL) Bacillus subtilis 6633
Dihidrostreptomisin (T) Klebsiella pneumoniae 10031
Doksisiklin Staphylococcus aureus 29737
Eritromisin Micrococcus luteus 9341
Gentamisin Staphylococcus epidermidis 12228
Gramisidin Enterococcus hirae 10541
Kanamisin Staphylococcus aureus 29737
Kandisidin Saccharomyces cerevisiae 9763
Kapreomisin Klebsiella pneumoniae 10031
Karbenisilin Pseudomonas aeruginosa 25619
Kloksasilin Staphylococcus aureus 29737
Kloramfenikol Escherichia coli 10536
Klortetrasiklin Staphylococcus aureus 29737
Kolistin Bordetella bronchiseptica 4617
Metasiklin Staphylococcus aureus 29737
Nafsilin Staphylococcus aureus 29737
Natrium kolistimetat Bordetella bronchiseptica 4617
Neomisin (CL) Staphylococcus epidermidis 12228
Neomisin (T) Klebsiella pneumoniae 10031
Netilmisin Staphylococcus epidermidis 12228
Nistatin Saccharomyces cerevisiae 2601
Novobiosin Staphylococcus epidermidis 12228
Oksitetrasiklin Staphylococcus aureus 29737
Paramomisin Staphylococcus epidermidis 12228
Penisilin G Staphylococcus aureus 29737
Polimiksin B Bordetella bronchiseptica 4617
Rolitetrasiklin Staphylococcus aureus 29737
Sefalotin Staphylococcus aureus 29737
Sefapirin Staphylococcus aureus 29737
Sikloserin Staphylococcus aureus 29737
Sisomisin Staphylococcus epidermidis 12228
Spektinomisin Escherichia coli 10536
Streptomisin (T) Klebsiella pneumoniae 10031
Tetrasiklin Staphylococcus aureus 29737
Tilosin Staphylococcus aureus 9144
Tiostrepton (T) Enterococcus hirae 10541
Tobramisin Staphylococcus aureus 29737
Troleandomisin Klebsiella pneumoniae 10031
Vankomisin Bacillus subtilis 6633
- 1397 -
PENYIAPAN SAMPEL
Dari informasi yang ada untuk penyiapan sediaan yang
akan diuji (contoh), berikan potensi perkiraan tiap satuan
bobot atau volume dan berdasarkan perkiraan ini, pada
hari penetapan buat larutan persediaan serta enceran
larutan uji seperti tertera pada setiap antibiotik dengan
pengencer akhir yang sama seperti untuk baku
pembanding. Penetapan memakai 5 tingkat dosis
baku, memerlukan hanya 1 tingkat dosis sampel pada
kadar perkiraan sama dengan tingkat dosis tengah baku.
MIKROBA DAN INOKULA
Mikroba Uji
Mikroba uji untuk tiap antibiotik tertera pada Tabel 2
beserta nomor identifikasi American Type Culture
Collection (ATCC) yang bersangkutan. Metode penetapan
dengan mikroba uji ini tertera pada Tabel 1. Pelihara
biakan pada media agar miring dengan kondisi inkubasi
seperti tertera pada Tabel 3 dan pindahkan setiap minggu
pada agar miring yang baru. Untuk Klebsiella
pneumoniae pakailah biakan tidak berkapsul. Untuk
Enterococcus hirae dapat dipakai biakan tusukan
(“stab cultures”).
Penyiapan Inokula
Untuk persiapan penetapan, lepaskan biakan segar
mikroba dari agar miring atau biakan lain dalam 3 ml
natrium klorida P dan butiran kaca steril.
Inokulasikan ke permukaan 250 ml media agar seperti
tertera pada Tabel 3 dalam sebuah botol Roux, kecuali
untuk Enterococcus hirae dan Staphylococcus aureus
(ATCC 9144), dibiakkan dalam media cair. Sebarkan
suspensi secara merata ke atas permukaan agar dengan
bantuan butiran kaca steril dan inkubasikan pada suhu yang
ditetapkan selama waktu tertentu. Pada akhir periode
inkubasi, buat suspensi persediaan dengan mengumpulkan
biakan ke dalam 50 ml larutan natrium klorida P 0,9% steril,
kecuali untuk bleomisin (pakailah 50 ml Media 34).
Tetapkan dengan percobaan, jumlah suspensi
persediaan yang dimasukkan untuk Inokula, dimulai
dengan volume yang tertera pada Tabel 3. Percobaan
harus diinkubasikan sesuai waktu yang tertera pada
Metode Turbidimetri di bagian procedure . Sesuaikan
jumlah Inokula pada kebutuhan perhari, jika dibutuhkan,
untuk mendapatkan suatu hubungan dosis-respon yang
optimum dari jumlah pertumbuhan mikroba uji di dalam
tabung dan lama waktu inkubasinya. Pada saat periode
inkubasi selesai sesuai dengan yang tertera pada Metode
Turbidimetri di bagian procedure , tabung yang
mengandung dosis tengah dari Larutan Baku harus
memiliki serapan paling sedikit 0,3; kecuali untuk
amikasin, klortetrasiklin, gramisidin, dan tetrasiklin
(serapannya 0,35), dan kapreomisin, metasiklin, dan
tobramisin (serapannya 0,4).
Untuk penetapan dengan cara Lempeng-Silinder
tetapkan dengan percobaan untuk mengatur jumlah
suspensi persediaan yang dimasukkan untuk inokula,
dimulai dengan volume yang tertera pada Tabel 3 sampai
menghasilkan batas daerah hambatan yang memuaskan
dengan diameter lebih kurang 14 - 16 mm dan
memberi suatu hubungan dosis yang reprodusibel.
Buat inokula dengan menambahkan beberapa suspensi
persediaan ke dalam media agar yang telah dicairkan dan
didinginkan sampai suhu 45° - 50°, putar sampai
diperoleh suspensi homogen.
TABEL 3
PENYIAPAN INOKULA
Mikroba uji & (Nomor ATCC)
Kondisi Inkubasi Komposisi inokula yang
dianjurkan
Antibiotik yang ditetapkan
Media Suhu (°) Waktu
(jam)
Media Jumlah (ml
per 100 ml)
Bacillus subtilis (6633) 32
32-35
5 hari
5
8
**
**
Dihidrostreptomisin,
Vankomisin
Bordetella bronchiseptica (4617) 1 32-35 24 10 0,1 Natrium kolistimetat, Kolistin, Polimiksin B
Escherichia coli (10536) 1 32-35 24 3 0,7 Kloramfenikol
Klebsiella pneumoniae (10031) 1 36 - 37,5 16 - 24 3
39
0,05
0,1
2
Kapreomisin
Streptomisin,Troleandomisin,Dihidrostreptomisin
Neomisin
Micrococcus luteus (9341) 1 32-35 24 11 1,5 Eritromisin
Micrococcus luteus (10240) 1 32-35 24 1 0,3 Basitrasin
Mycobacterium smegmatis (607) 36 36 – 37,5 48 35 1,0 Bleomisin
Pseudomonas aeruginosa (25619) 1 36 – 37,5 24 10 0,5 Karbenisilin
Saccharomyces cerevisiae (9763) 19 29 - 31 48 13
19
0,2
1,0
Kandisidin
Amfoterisin B
Saccharomyces cerevisiae (2601) 19 29 – 31 48 19 1,0 Nistatin
Staphylococcus aureus (9144) 3 35 - 39 16-18 39 2-3 Tilosin
- 1398 -
Mikroba uji & (Nomor ATCC)
Kondisi Inkubasi Komposisi inokula yang
dianjurkan
Antibiotik yang ditetapkan
Media Suhu (°) Waktu
(jam)
Media Jumlah (ml
per 100 ml)
Staphylococcus aureus (29737) 1 32 - 35 24 1
1
1
3
3
3
3
0,1
0,3
1,0
0,1
0,2
0,4
0,15
Sefalotin, Sefapirin, Kloksasilin
Nafsilin
Penisilin G
Amikasin, Klortetrasiklin, Demeklosiklin,
Doksisiklin, Metasiklin, Oksitetrasiklin,
Rolitetrasiklin, Tetrasiklin
Kanamisin
Sikloserin
Tobramisin
Staphylococcus epidermidis
(12228)
1 32 - 35 24 11
1
11
11
11
0,25
4,0
0,03
0,4
2,0
Netilmisin
Novobiosin
Gentamisin, Sisomisin
Neomisin
Paromomisin
Enterococcus hirae (10541) 3
40
36 – 37,5
36 – 37,5
16 – 18
18 - 24
3
41
1,0
0,2
Gramisidin
Tiostrepton
** Seperti yang disyaratkan.
[Catatan Pada penetapan Karbenisin untuk Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25619), pakailah 0,5 ml dari pengenceran 1:25 dari larutan stok suspensi
per 100 ml Medium 10.].
CARA PENGUJIAN
Desain Penetapan
Penetapan secara mikrobiologi memperoleh presisi
yang meyakinkan melalui pemisahan sumber-sumber
penyebab kesalahan potensial serta bias yang relatif besar
dengan memakai desain penetapan yang sesuai. Pada
penetapan dengan metode Lempeng-Silinder,
perbandingan pokok dibatasi pada hubungan pengukuran
diameter hambatan antar cawan, tidak termasuk variasi di
antara cawan pada penyiapannya dan penanganan
berikutnya. Untuk melaksanakan penetapan dengan
turbidimetri sesampai perbedaan kekeruhan yang diamati
akan menggambarkan perbedaan kadar antibiotik,
diperlukan keseragaman suhu tabung melalui pengendali
termostatik dalam inkubator dan penghindaran bias
sistematik dengan penempatan tabung secara acak dalam
rak terpisah, tiap rak terdiri dari satu set perlakuan yang
lengkap. Perbandingan pokok lalu dibatasi pada
hubungan antara kekeruhan yang diamati pada tiap rak.
[Catatan: Untuk beberapa tujuan, desain penetapan
diatur sedemikian rupa sampai tiap satu set perlakuan
terdiri dari tidak kurang dari 3 tabung untuk tiap kadar
sampel dan kadar baku, dan tiap set ditempatkan dalam
satu rak.]
Dengan pembatasan ini, dianjurkan memakai
desain penetapan satu tingkat dosis dengan suatu kurva
baku. Pada penetapan dengan kurva baku, buat
pengenceran larutan sebanyak 5, 6 atau lebih, diantaranya
satu kadar sesuai dengan kadar acuan (S3) baku dan
larutan uji dengan satu tingkat dosis tengah seperti tertera
pada Penyiapan Larutan Baku dan Sediaan Uji. Suatu
penetapan dipandang sebagai penetapan pendahuluan jika
potensi yang dihitung kurang dari 80% atau lebih dari
125% dari yang diperkirakan pada penyiapan larutan uji
persediaan. Dalam hal ini, tentukan potensi perkiraan
yang sesuai dan ulangi penetapan.
Penetapan potensi secara mikrobiologi dipengaruhi
oleh variabel antar-penetapan dan intra-penetapan,
sesampai diperlukan dua atau lebih penetapan yang
berdiri sendiri untuk perkiraan potensi yang dapat
dipercaya dari penetapan sediaan tertentu atau sediaan uji.
Penetapan diawali dengan pembuatan terpisah larutan
persediaan dan pengenceran baik baku maupun sediaan
uji, ulangi penetapan sediaan uji pada hari yang berbeda.
Jika potensi perkiraan pada penetapan kedua berbeda
secara menonjol dari yang pertama, ditunjukkan oleh
kesalahan baku terhitung, maka lakukan satu atau lebih
penetapan tambahan. Gabungan hasil suatu seri kecil
penetapan yang berdiri sendiri dalam sebaran beberapa
hari merupakan perkiraan potensi yang lebih dipercaya
daripada satu penetapan yang besar dengan jumlah
keseluruhan cawan atau tabung yang sama.
Metode Lempeng-Silinder
Untuk mempersiapkan penetapan memakai cawan
Petri, tuang 21 ml Media 2 ke dalam masing-masing
beberapa cawan yang diperlukan, dan biarkan memadat
sebagai lapisan dasar yang licin dengan ketebalan
seragam, kecuali untuk amfoterisin B dan nistatin, tidak
dipakai lapisan dasar yang terpisah. Untuk eritromisin,
entamisin, neomisin B, paromomisin, dan sisomisin
pakailah Media 11. Untuk bleomisin, pakailah 10 ml
Media 35. Untuk dihidrostreptomisn pakailah Media 5.
Untuk vankomisin, pakailah 10 ml Media 8. Untuk
karbenisilin, natrium kolistimetat, kolistin, dan polimiksin
B, pakailah Media 9. Untuk netilmisin, pakailah 20 ml
Media 11. Tambahkan 4 ml lapisan inokula (lihat
Penyiapan Inokula dan Tabel 3), buat seperti tertera untuk
masing-masing antibiotik, kecuali untuk bleomisin
(pakailah 6 ml), untuk netilmisin (pakailah 5 ml), untuk
nistatin dan amfoterisin B (pakailah 8 ml), putarkan cawan
untuk menyebar-ratakan inokula pada permukaan dan
biarkan memadat. Jatuhkan 6 buah silinder pada permukaan
- 1399 -
yang telah diinokulasi dari ketinggian 12 mm,
memakai alat mekanik atau alat lain untuk menjamin
penempatannya pada radius 2,8 cm, lalu tutup cawan
untuk mencegah kontaminasi. sesudah ke-6 silinder pada
tiap cawan Petri diisi dengan enceran larutan antibiotik
seperti tertera di bawah ini, inkubasi cawan pada suhu 32° -
35°, atau pada suhu seperti tertera di bawah ini sesuai
dengan masing-masing antibiotik selama 16 - 18 jam.
Ambil semua silinder, ukur dan catat diameter tiap
hambatan pertumbuhan sampai mendekati 0,1 mm.
Inkubasi cawan pada suhu 29° - 31º untuk amfoterisin B
dan nistatin. Inkubasi novobiosin pada suhu 34° - 36°.
Inkubasi pada suhu 36° - 37,5° untuk Karbenisilin, natrium
kolistimetat, kolistin, dihidrostreptomisin, gentamisin,
neomisin, netilmisin, paromomisin, polimiksin B,
sisomisin, dan vankomisin.
Pada penetapan 1 tingkat dosis dengan kurva baku, buat
pengenceran dengan 5 tingkat dosis baku (S1 - S5) dan satu
tingkat dosis uji (U3) yang sesuai dengan S3 kurva baku,
seperti tertera pada Penyiapan Baku dan Penyiapan
Sampel Uji. Untuk memperoleh kurva baku, isi silinder
selang-seling pada tiap 3 cawan dengan dosis tengah baku
(S3) dan tiap silinder dari 9 silinder sisanya dengan satu
dari empat pengenceran larutan baku. Lakukan hal yang
sama untuk 3 pengenceran baku lainnya. Untuk tiap
sediaan uji, isi silinder selang-seling pada tiap 3 cawan
dengan dosis tengah baku (S3) dan 9 silinder sisa dengan
enceran larutan uji yang sebanding (U3).
Metode Turbidimetri
Pada hari penetapan, siapkan dosis yang diperlukan
dengan mengencerkan larutan persediaan baku dan tiap
larutan uji seperti tertera pada Penyiapan Baku dan
Penyiapan Sampel. Tambahkan 1 ml tiap dosis, kecuali
untuk gramisidin, tiostrepton, dan tilosin (pakailah
0,10 ml) pada masing-masing 3 tabung reaksi yang telah
disiapkan dan tempatkan 3 replikat tabung dengan posisi
secara acak pada rak tabung. Secara bersamaan letakkan
pada tiap rak 1 tabung atau 2 tabung kontrol yang berisi
1 ml pengencer tanpa antibiotik (lihat Tabel 1) . sesudah
selesai semua pengisian larutan (untuk kandisidin dalam
waktu 30 menit ketika air ditambahkan pada Larutan
persediaan metilsulfoksida ), tambahkan 9,0 ml inokula
ke dalam tiap tabung pada rak dan sesudah lengkap
pengisian rak segera ditempatkan dalam inkubator atau
tangas air dengan suhu yang dipertahankan pada
36° - 37,5° kecuali untuk kandisidin (inkubasi pada suhu
27° - 29°). Inkubasi tabung selama 4 - 5 jam, kecuali
untuk kapreomisin, kloramfenikol, sikloserin,
dihidrostreptomisin, spektinomisin, streptomisin, dan
troleandomisin (inkubasi selama 3 - 4 jam), tilosin
(inkubasi selama 3 - 5 jam), dan kandisidin (inkubasi
selama 16 - 18 jam). sesudah inkubasi, tambahkan 0,5 ml
larutan formaldehida encer ke dalam tiap tabung, kecuali
untuk tilosin (panaskan rak di dalam tangas air pada suhu
80° - 90° selama 2 - 6 menit atau di dalam tangas uap
selama 5 - 10 menit, dan biarkan sampai suhu kamar),
ambil satu rak sekaligus, dan ukur transmitans atau
serapannya dengan spektrofotometer yang sesuai pada
530 nm atau 580 nm (lihat Spektrofotometer pada bagian
Peralatan).
Pada penetapan 1 tingkat dosis dengan kurva baku,
buat pengenceran sampai 5 tingkat dosis larutan baku (S1
sampai S5) dan satu tingkat dosis larutan uji (U3) dari tiap
sediaan sampai dengan 20 sediaan uji yang sama dengan
S3 baku. Buat juga satu S3 tambahan sebagai uji
pertumbuhan. Tambahkan 1 ml masing-masing larutan
uji, kecuali untuk gramisidin, tiostrepton, dan tilosin
(pakailah 0,10 ml). pada 3 tabung dan 1 ml pengencer
bebas antibiotik pada 6 tabung sebagai kontrol. Letakkan
secara acak satu set lengkap, termasuk 2 tabung kontrol
pada satu rak tabung. Tambahkan 9,0 ml inokula, kecuali
untuk tiostrepton (pakailah 10,0 ml inokula),
inkubasikan, tambahkan 0,5 ml formaldehida encer dan
akhiri penetapan di atas. Tetapkan masa inkubasi yang
pasti dengan mengamati pertumbuhan pada kadar rujukan
(dosis tengah) pengenceran baku (S3).
CARA PERHITUNGAN
Untuk menghitung potensi dari data yang diperoleh
dengan metode lempeng silinder atau turbidimetri
lakukan seperti tertera pada Potensi hasil interpolasi dari
kurva baku seperti tertera pada Desain dan analisa
Penetapan Hayati <81>, memakai metode garis
lurus transformasi log dengan procedure penyesuaian
kuadrat terkecil dan uji linieritas. Bila beberapa
penetapan dari bahan uji yang sama dilakukan
memakai kurva baku yang sama, hitung koefisien
variasi dari hasil semua penetapan bahan uji. Bila lebih
dari satu penetapan dilakukan untuk bahan uji dengan
kurva baku yang berbeda, buat rata-rata dari dua atau
lebih nilai potensi.
PENETAPAN POTENSI FRAKSI FAKTOR
VIII <141>
Potensi fraksi faktor VIII ditetapkan dengan
membandingkan jumlah yang diperlukan untuk
mengurangi waktu jendal campuran uji yang
mengandung semua zat yang berperan dalam penjendalan
darah, dengan beberapa sediaan baku yang diperlukan
untuk menimbulkan efek sama dalam kondisi metode
penetapan yang sesuai. Metode tahap tunggal dapat
dipakai jika memberi hasil yang tidak berbeda
bermakna, memakai sediaan baku, dengan
memperhatikan ketelitian metode.
Baku pembanding Faktor Koagulasi VIII Darah
Manusia BPFI.
Metode Rekonstitusi seluruh isi satu ampul Faktor
Koagulasi VIII Darah Manusia BPFI dengan 1 ml air,
pakailah segera. Ke dalam Faktor Koagulasi VIII Darah
Manusia BPFI yang telah direkonstitusi dan sediaan uji
tambahkan Dapar imidazol pH 7,3 secukupnya sampai
kadar antara 0,5 dan 2 unit per ml; larutan stabil selama
15 menit pada suhu 20º. Buat 3 pengenceran dengan
saksama berturut-turut berkelipatan dua dalam rentang (1
- 1400 -
dalam 16) sampai (1 dalam 256) memakai campuran
1 bagian volume larutan trinatrium sitrat P 3,8% dan
5 bagian volume larutan natrium klorida P 0,9% sampai
waktu jendal antara 17 detik dan 35 detik, pakailah
segera. Masukkan ke dalam 6 tabung (75 mm x 10 mm)
masing-masing 0,1 ml Larutan faktor jendal V, Pereaksi
fosfolipida dan Pereaksi serum normal. Ke dalam tabung
pertama, tambahkan 0,1 ml larutan baku pengenceran
tertinggi, tempatkan tabung dalam tangas air pada suhu
37º, tambahkan 0,1 ml kalsium klorida 0,05 M dan mulai
hitung waktu memakai penghitung detik. Menit
berikutnya tambahkan 0,1 ml larutan baku pengenceran
tertinggi kedua ke dalam tabung kedua, tempatkan tabung
ke dalam tangas air dan tambahkan 0,1 ml kalsium
klorida 0,05 M pada saat 1 menit memakai
penghitung detik. Ulangi procedure untuk larutan baku
pengenceran terendah dan larutan uji pengenceran
tertinggi sampai terendah sampai kalsium klorida
ditambahkan pada saat 2 menit, 3 menit, 4 menit dan
5 menit masing-masing memakai penghitung detik.
Siapkan 12 tabung kaca masing-masing mengandung
0,2 ml kalsium klorida 0,025 M dan tabung selanjutnya
mengandung 3 ml Plasma substrat. Masukkan dalam
tangas air pada suhu 37º. Pada saat 14 menit 40 detik
dengan penghitung detik, masukkan 0,1 ml campuran dari
tabung inkubasi pertama ke dalam satu tabung yang
mengandung 0,2 ml larutan kalsium klorida P dan
campur. Pada saat 15 menit, tambahkan 0,2 ml Plasma
substrat hangat dan memakai penghitung detik
kedua, catat sebagai waktu jendal, interval antara
penambahan Plasma substrat dan indikasi pertama
terbentuknya fibrin yang dapat dilihat secara visual atau
dengan alat mekanik. Ulangi procedure memakai
tabung inkubasi lain pada interval 1 menit dan lakukan
penetapan seri kedua pada saat 21 - 26 menit. Periode
inkubasi diatur sampai waktu jendal dari penetapan yang
berkaitan dalam dua seri tidak berbeda lebih dari 5%, dan
menampilkan pembentukan aktivator protrombin plato
stabil telah tercapai. Untuk memastikan tidak ada
cemaran bermakna dari pereaksi dengan faktor jendal
VIII, lakukan penetapan blangko dengan cara larutan uji
diganti dengan beberapa setara campuran 1 bagian
volume larutan trinatrium sitrat P 3,8% dan 5 bagian
volume larutan natrium klorida P 0,9%. Hasil penetapan
tidak absah jika waktu jendal yang dicatat dalam
penetapan blangko kurang dari 40 detik. Hitung hasil
penetapan memakai metode statistik baku.
Pereaksi
Larutan faktor jendal V Larutan faktor jendal V
dibuat dengan metode di bawah ini atau dengan metode
lain dengan meniadakan faktor VIII. Buat dari plasma
segar sapi beroksalat dengan fraksinasi pada suhu 4º
dengan larutan jenuh amonium sulfat P yang dibuat pada
suhu 4º. pakailah fraksi yang mengendap pada kejenuhan
antara 38% dan 50% (mengandung faktor jendal V tidak
tercemar dengan faktor jendal VIII secara bermakna),
dialisa untuk menghilangkan amonium sulfat dan
encerkan dengan larutan natrium klorida P 0,9% sampai
diperoleh larutan yang mengandung antara 10 dan 20 %
jumlah faktor jendal V yang ada dalam plasma segar
normal manusia.
Tetapkan kandungan faktor jendal V dalam larutan
dengan cara sebagai berikut: Buat dua pengenceran dalam
Dapar imidazol pH 7,3 yang mengandung 1 bagian
volume larutan uji dalam 10 bagian volume dan 20
bagian volume. Lakukan uji pada tiap pengenceran
sebagai berikut: Campur masing-masing 0,1 ml Plasma
substrat kekurangan faktor jendal V, enceran larutan uji,
ekstrak trombokinase dan kalsium klorida 0,025 M. Catat
sebagai waktu jendal, interval antara penambahan larutan
kalsium klorida dan indikasi pertama terbentuk fibrin
yang dapat dilihat secara visual atau dengan alat mekanik.
Dengan cara yang sama lakukan penetapan waktu
jendal rangkap dua, untuk 4 pengenceran dari kumpulan
plasma normal manusia dalam Dapar imidazol pH 7,3
yang masing-masing mengandung 1 bagian volume
dalam 10 bagian volume (setara dengan 100% faktor
jendal V), 50 bagian volume (20%), 100 bagian volume
(10%) dan 1000 bagian volume (1%).
Untuk menghitung hasil waktu jendal, buat rata-rata
waktu jendal untuk setiap pengenceran plasma manusia
pada kertas grafik log putaran ganda terhadap kesetaraan
persentase faktor jendal V dan baca persentase faktor
jendal V untuk dua pengenceran dari Larutan faktor
jendal V dengan cara interpolasi kurva. Rata-rata dari dua
hasil yang diperoleh sebagai persentase faktor jendal V
dalam larutan.
Pereaksi serum normal Kumpulkan darah normal
manusia dalam botol kaca kering steril, inkubasi pada
suhu 37º selama 3 jam, biarkan pada suhu 4º selama
semalam, pisahkan serum, beku keringkan dan simpan
dalam desikator hampa udara di atas fosfor pentoksida P.
Larutkan beberapa serum kering yang dihitung diperoleh
dari 1 ml serum dalam Dapar imidazol pH 7,3
secukupnya sampai 10 ml dan biarkan pada suhu 4º
selama 24 - 36 jam.
Otak lembu jantan yang dikeringkan dengan aseton
Potong otak segar lembu jantan yang sebelumnya telah
dibebaskan dari pembuluh darah dan jaringan ikat
menjadi bagian kecil. Masukkan ke dalam aseton P untuk
dehidrasi awal. Sempurnakan dehidrasi dengan cara
menumbuk beberapa 30 g bahan di dalam mortir
beberapa kali berturut-turut dengan 75 ml aseton P di
dalam mortir, beberapa kali berturut-turut sampai
diperoleh serbuk kering sesudah penyaringan. lalu
keringkan pada suhu 37º selama 2 jam sampai semua sisa
aseton menguap.
Fosfolipida Cuci beberapa otak manusia normal atau
otak sapi dan bebaskan dari selaput otak dan pembuluh
darah dan maserasi dalam alat pencampur yang sesuai.
Timbang 1000 - 1300 g maserat dan ukur volume (v ml).
Ekstraksi tiga kali, tiap kali dengan 4 kali v ml aseton P,
saring dengan diisap dan keringkan endapan pada suhu
37º selama semalam. Ekstraksi endapan kering dua kali,
tiap kali dengan 2 kali v ml campuran 2 bagian volume
eter minyak tanah P (jarak didih 30º - 40º) dan 3 bagian
volume eter minyak tanah P (jarak didih 40º - 60º), saring
masing-masing ekstrak melalui kertas saring yang
sebelumnya telah dicuci dengan campuran eter minyak
- 1401 -
tanah. Kumpulkan ekstrak dan uapkan sampai kering
pada suhu 45º pada tekanan tidak lebih dari 5 mmHg.
Larutkan sisa dalam 0,2 v ml eter P dan biarkan pada
suhu 4º sampai terbentuk endapan. Sentrifus dan uapkan
beningan di bawah pengurangan tekanan sampai volume
lebih kurang 100 ml per kg dari maserat asal. Biarkan
pada suhu 4º sampai terbentuk endapan (12 - 24 jam) dan
sentrifus. Ke dalam beningan tambahkan 5 bagian
volume aseton P, sentrifus, buang beningan, keringkan
endapan dan simpan dalam desikator hampa udara,
terlindung cahaya.
Pereaksi fosfolipida Suspensikan 125 mg fosfolipida
dalam 5 ml air, kocok dan aduk sampai diperoleh
suspensi yang homogen. Buat pengenceran dengan
larutan natrium klorida P 0,9% sampai memberi
perbedaan waktu jendal minimum sesuai dengan
perbedaan waktu jendal terbesar antara pengenceran
berturut-turut dari sediaan baku dan sediaan uji.
biasanya kadar antara 50 μg dan 250 μg per ml.
Suspensi encer dapat disimpan pada suhu -20º selama
6 minggu.
Plasma substrat Pisahkan plasma dari 9 bagian volume
darah manusia atau darah sapi yang ditampung dalam 1
bagian volume larutan trinatrium sitrat P 3,8% atau dari
3,5 bagian volume darah manusia atau darah sapi yang
ditampung dalam 1 bagian volume larutan yang
mengandung dinatrium hidrogen sitrat P 2% dan
D-glukosa P 2,5%. Pada masalah pertama, Plasma substrat
dibuat pada hari pengambilan darah. Pada masalah kedua,
Plasma substrat dapat dibuat sampai 2 hari sesudah
pengambilan darah.
Plasma substrat kekurangan faktor jendal V Sebaiknya
pakailah plasma yang berkekurangan bawaan atau dibuat
dengan cara sebagai berikut: Pisahkan plasma dari darah
manusia yang dikumpulkan dalam 0,1 bagian volume
larutan natrium oksalat P 1,34% dan inkubasi pada suhu
37º selama 24 - 36 jam. Plasma ini harus memiliki
waktu jendal dari 70 detik sampai 100 detik, jika
dilakukan penetapan seperti tertera pada penetapan
kandungan dalam Larutan faktor jendal V; jika waktu
jendal kurang dari 70 detik, inkubasi plasma selama
12 - 24 jam lagi. Simpan dalam jumlah kecil pada suhu
20º atau di bawah -20º.
Ekstrak trombokinase Ekstraksi 1,5 g Otak lembu
jantan yang dikeringkan dengan aseton dalam 60 ml air
pada suhu 50º selama 10 - 15 menit, sentrifus selama
2 menit pada 1500 rpm dan tuang beningan. Aktivitas
ekstrak ini akan bertahan beberapa hari jika disimpan di
dalam lemari pendingin. Larutan kresol P 0,03% dapat
ditambahkan sebagai bakterisida.
PENETAPAN POTENSI FRAKSI FAKTOR IX
<151>
Potensi fraksi faktor IX ditetapkan dengan
membandingkan jumlah sediaan uji yang diperlukan
.jpg)
