detektor ionisasi nyala dan kolom kaca 1,8 m x 2 mm
berisi bahan pengisi 0,2% tahap diam G39 pada partikel
penyangga S7. pakailah nitrogen P sebagai gas pembawa
dengan laju alir lebih kurang 20 ml per menit. Suhu
injektor dan suhu detektor dipertahankan pada 200°. Atur
suhu kolom sebagai berikut: pertahankan suhu pada 80°
selama 2 menit, lalu naikkan sampai suhu 150°
dengan kecepatan 30° per menit, lalu pertahankan
suhu 150° selama 5 menit. Suntikkan 1 ml tahap gas dari
Larutan kesesuaian sistem seperti tertera pada procedure :
resolusi, R, antara etanol dan metilen klorida tidak kurang
dari 1,5, dan waktu retensi relatif puncak etanol lebih
kurang 0,8 terhadap puncak metilen klorida. Simpangan
baku relatif pada penyuntikan ulang Larutan baku tidak
lebih dari 5,0%.
Tabel 2
Kondisi
kromatografi
Penentuan
kolom
Ukuran kolom Suhu kolom
A S3 2 m x 3 mm 190°
B S2 2,1 m x 3 mm 160°
C G16 30 m x 0,53 mm 40°
D G39 2 m x 3 mm 65°
E G16 2 m x 3 mm 70°
F S4 2 ,5 m x 2 mm Pertahankan 120° (35 menit),
Gradien 120° - 200° (2°/menit)
Pertahankan 20 menit
H G14 2 ,5 m x 2 mm Pertahankan 45° (3 menit),
Gradien 45° - 120° (8°/menit)
Pertahankan 15 menit
I G27 30 m x 0,53 mm Pertahankan 35° (5 menit),
35° - 175° (8°/menit)
175° - 260° (35°/menit)
Pertahankan 16 menit
J G16 30 m x 0,33 mm Pertahankan 50° (20 menit),
50° - 165° (6°/menit)
Pertahankan 20 menit
- 1449 -
procedure pakailah alat suntik kedap gas, suntikkan
secara terpisah beberapa volume sama (lebih kurang
1 ml) gas dari ruang kosong di bagian atas Larutan baku
dan Larutan uji ke dalam kromatograf. Rekam
kromatogram dan ukur respons puncak. Tetapkan,
berdasarkan perbandingan waktu retensi, adanya metilen
klorida dalam Larutan uji. Tetapkan jumlah metilen
klorida yang terdeteksi, dalam μg per tablet. Hitung
jumlah maksimum metilen klorida, dalam μg per tablet
per hari yang diperbolehkan dalam unit dosis dengan
rumus:
Jumlah maksimum yang diperbolehkan (μg/hari/tablet) =
500 (μg/hari) kekuatan tablet seperti
X yang tertera pada
Dosis maksimum etiket (mg/tablet)
per hari (mg)
Jumlah metilen klorida yang terdeteksi per tablet tidak
boleh lebih dari jumlah maksimum yang diperbolehkan
menurut hasil perhitungan.
CEMARAN UMUM <481>
Uji cemaran umum yang tertera pada masing-masing
monografi dipakai untuk menilai profil cemaran suatu
bahan. Cemaran umum didefinisikan sebagai bahan yang
ada dalam senyawa obat dan/atau sediaan obat dalam
jumlah tertentu memiliki aktivitas biologi yang tidak
diinginkan. Cemaran ini dapat timbul akibat sintesa,
proses pembuatan sediaan, atau peruraian bahan. Dalam
beberapa masalah , cemaran yang berisiko terhadap
kesehatan dapat diidentifikasi. Pada bab ini masing-
masing cemaran tidak akan diidentifikasi, uji terpisah
mungkin diperlukan untuk memastikan bahwa cemaran
yang diidentifikasi telah memenuhi persyaratan batas
seperti tertera dalam definisi cemaran umum. Pemilihan
uji dan penetapan kadar memungkinkan untuk
menetapkan jumlah cemaran yang dapat diterima pada
suatu bahan untuk dipakai .
Laporan dan persyaratan Jumlah cemaran umum
tidak lebih dari 2,0%, kecuali dinyatakan lain pada
masing-masing monografi.
Jika pada monografi tertera batas komponen tertentu
dan/atau cemaran atau produk terurai yang dapat
diidentifikasi, cemaran umum tidak termasuk dalam
perhitungan total cemaran kecuali dinyatakan lain dalam
monografi. Komponen yang ada bersama-sama dalam
bahan didefinisikan sebagai bahan tertentu dari sediaan
obat yang tidak dianggap sebagai cemaran dalam konteks
farmakope. Contoh komponen yang ada bersama-sama
dalam bahan ini yaitu campuran isomer geometrik dan
optik (atau rasemat) dan antibiotik. Komponen lain yang
dianggap toksik sebab efek biologis tertentu yang tidak
diinginkan tidak disebut sebagai komponen yang ada
bersama-sama dengan bahan.
Metode Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing
monografi, perhitungan persentase dan jumlah cemaran
umum ditetapkan dengan metode relatif daripada
membandingkan dengan masing-masing baku
pembanding. Deteksi cemaran lain yang tidak spesifik
juga sesuai dengan metode ini.
Uji khas cemaran umum memakai teknik
Kromatografi lapis tipis. Lakukan seperti tertera pada
Kromatografi <931>. Uji untuk senyawa sejenis atau
kemurnian kromatografi dapat juga dipakai untuk
evaluasi cemaran umum. Metode lain (seperti
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Kromatografi Lapis
Tipis Kinerja Tinggi) dapat juga dipakai sebagai
metode alternatif dengan alasan yang jelas. Jika tidak
dicantumkan pada masing-masing monografi, pakailah
metode berikut.
Larutan uji Buat saksama dalam pelarut seperti tertera
pada monografi, sampai kadar lebih kurang 10 mg per
ml.[Catatan Pemanasan atau sonikasi dapat dipakai
untuk melarutkan jika hal ini tidak merusak bahan.]
Larutan baku Buat saksama larutan Baku
Pembanding FI dalam pelarut seperti tertera pada
monografi sampai kadar 0,01;0,05;0,1 dan 0,2 mg per ml.
[Catatan Pemanasan atau sonikasi dapat dipakai
untuk melarutkan jika hal ini tidak merusak bahan.]
procedure Lakukan Kromatografi lapis tipis
memakai lempeng silika gel P setebal 0,25 mm dan
tahap gerak seperti tertera pada monografi. Totolkan
secara terpisah beberapa volume sama (lebih kurang
20 μl) Larutan uji dan Larutan baku, pakailah aliran
nitrogen P untuk mengeringkan bercak. Masukkan
lempeng ke dalam bejana kromatografi yang telah
dijenuhkan dengan tahap gerak sampai merambat lebih
kurang tiga per empat tinggi lempeng. Angkat lempeng,
keringkan diudara. Amati lempeng memakai teknik
penampakan bercak yang tertera. Tentukan intensitas
relatif bercak lain selain bercak utama Larutan uji dengan
membandingkan terhadap kromatogram Larutan baku.
Petunjuk Teknik Penampak Bercak
(1) pakailah cahaya ultra violet pada 254 nm dan
366 nm.
(2) pakailah iodoplatinat LP.
(3) Larutan A Buat campuran 850 mg bismut subnitrat
P dengan 40 ml air dan 10 ml asam asetat glasial P.
Larutan B Larutkan 8 g kalium iodida P dalam
20 ml air. Campur Larutan A dan B sampai diperoleh
Larutan persediaan yang dapat disimpan beberapa bulan
dalam botol gelap. Campur 10 ml Larutan persediaan
dengan 20 ml asam asetat glasial P, encerkan dengan air
sampai 100 ml, untuk larutan penampak bercak.
(4) Pereaksi penampak bercak ninhidrin Larutkan
200 mg ninhidrin P dalam 100 ml etanol P, panaskan
lempeng sesudah penyemprotan.
(5) Pereaksi penampak bercak asam Dalam tangas es,
tambahkan perlahan-lahan dan hati-hati sambil diaduk,
- 1450 -
10 ml asam sulfat P ke dalam 90 ml etanol P. Semprot
lempeng dan panaskan sampai timbul bercak.
(6) Pereaksi penampak bercak dikromat-asam
Tambahkan kalium dikromat P secukupnya ke dalam 100 ml
asam sulfat P sampai diperoleh larutan jenuh. Semprot
lempeng dan panaskan sampai timbul bercak.
(7) Vanilin Larutkan 1 g vanilin P dalam 100 ml asam
sulfat P.
(8) Kloramin T-asam trikloroasetat Campur 10 ml
dalam larutan kloramin T 3 % dalam air dengan 40 ml
larutan asam trikloroasetat P 25% dalam etanol P. Buat
larutan segar sebelum dipakai .
(9) Folin-C Tambahkan 10 g natrium tungstat P dan
2,5 g natrium moblidat P ke dalam 70 ml air, tambahkan
5 ml larutan asam fosfat P 85% dan 10 ml larutan asam
klorida P 36%, refluks larutan ini selama 10 jam.
(10) KMnO4 Larutkan 100 mg kalium permanganat P
dalam 100 ml air.
(11) DAB Campur 1 g p-dimetilamino-benzaldehida P
dalam 100 ml asam klorida 0,6 N.
(12) DAC Campur 100 mg p-dimetilamino-
sinamaldehida P dalam 100 ml asam klorida 1 N.
(13) Besi(III) sianida Campur beberapa volume yang
sama larutan besi(III) klorida P 1% dan larutan kalium
besi (II) sianida P 1%. pakailah segera.
(14) Fast Blue B - Pereaksi A larutkan 500 mg garam
Fast Blue B dalam 100 ml air.
Pereaksi B Natrium hidroksida 0,1 N.
Semprot mula-mula dengan Pereaksi A, lalu
dengan Pereaksi B.
(15) Besi(III) sianida basa Encerkan 1,5 ml larutan
kalium besi(III) sianida P 1% dengan air sampai 20 ml,
tambahkan 10 ml larutan natrium hidroksida P 15%.
(16) Pereaksi penampak bercak iodium Buat larutan
iodium P 0,5 % dalam kloroform P.
(17) Letakkan lempeng selama 10 menit dalam bejana
tertutup yang telah dijenuhkan dengan uap iodium dan
pada dasar bejana ada hablur iodium P.
(18) Larutan A Larutkan kalium iodida P dalam 50 ml air.
Larutan B buat larutan 500 mg pati larut P dalam
50 ml air panas.
Segera sebelum dipakai , campur beberapa volume
sama Larutan A dan Larutan B.
(19) PTSS Larutkan 20 g asam p-toluensulfonat P
dalam 100 ml etanol P, semprot lempeng, keringkan
selama 15 menit pada suhu 110°, amati dibawah cahaya
ultra violet pada 366 nm.
(20) Pereaksi penampak bercak o-tolidina Larutkan
160 mg o-tolidina P dalam 30 ml asam asetat glasial P.
Encerkan dengan air sampai 500 ml, tambahkan 1 g
kalium iodida P, aduk sampai larut.
(21) Campur 3 ml larutan asam kloroplatinat P (1
dalam 10), dengan 97 ml air, lalu tambahkan 100 ml
larutan kalium iodida P (6 dalam 100) untuk membuat
pereaksi penampak bercak.
(22) Pereaksi penampak bercak metanol-iodium Buat
campuran iodium LP dan metanol P (1:1).
LEMAK DAN MINYAK LEMAK <491>
Definisi dan procedure umum berikut dipakai
untuk lemak, minyak lemak, malam, resin, balsam dan
zat-zat sejenis.
Penyiapan Sampel
Bila contoh minyak menampilkan kekeruhan yang
disebabkan oleh pemisahan stearin, hangatkan wadah
dalam tangas air pada suhu 50° sampai minyak jernih,
atau bila minyak pada penghangatan tidak menjadi jernih,
saring melalui kertas saring kering pada corong yang
terletak di dalam mantel air panas. Campur dengan baik,
dan timbang sekaligus sebanyak yang diperlukan untuk
berbagai penetapan, sebaiknya memakai botol
berpipet tetes, atau buret timbang. Jaga contoh tetap
meleleh, jika pada suhu kamar berupa padatan, sampai
diperoleh beberapa yang diperlukan.
Bobot Jenis
Tetapkan bobot jenis lemak atau minyak lemak seperti
tertera pada Penetapan Bobot Jenis <981>.
Suhu Lebur
Tetapkan suhu lebur seperti tertera pada Penetapan Jarak
Lebur atau Suhu Lebur <1021> Metode lV.
Bilangan Asam (Asam Lemak Bebas)
Keasaman lemak dan minyak lemak dinyatakan sebagai
jumlah ml alkali 0,1 N yang diperlukan untuk
menetralkan asam bebas dalam 10,0 g zat. Keasaman
sering dinyatakan sebagai Bilangan asam, yaitu jumlah
mg kalium hidroksida yang diperlukan untuk menetralkan
asam bebas dalam 1,0 g zat. Kecuali dinyatakan lain
dalam masing-masing monografi, pakailah Metode I.
Metode I
procedure Kecuali dinyatakan lain, timbang saksama
lebih kurang 10,0 g zat, larutkan dalam labu yang berisi
50 ml campuran sama banyak etanol P-eter P dan telah
dinetralkan terhadap fenoftalein LP dengan kalium
hidroksida 0,1 N atau natrium hidroksida 0,1 N, kecuali
dinyatakan lain. Bila contoh tidak larut dalam pelarut
dingin, hubungkan labu dengan pendingin yang sesuai
dan hangatkan perlahan-lahan, sambil sering dikocok
sampai contoh larut. Tambahkan 1 ml fenolftalein LP,
dan titrasi dengan kalium hidroksida 0,1 N LV atau
natrium hidroksida 0,1 N LV sampai larutan berwarna
merah muda lemah yang tetap sesudah dikocok selama
30 detik. Hitung Bilangan asam atau jumlah ml alkali 0,1 N
yang diperlukan untuk menetralkan 10,0 g contoh (asam
lemak bebas). Hitung Bilangan asam dengan rumus:
- 1451 -
56,11 yaitu bobot molekul kalium hidroksida; V yaitu
volume, dalam ml; N yaitu normalitas larutan kalium
hidroksida atau larutan natrium hidroksida; W yaitu
bobot dalam g zat yang dipakai .
Jika volume kalium hidroksida 0,1 N LV atau natrium
hidroksida 0,1 N LV yang diperlukan untuk titrasi kurang
dari 2 ml, dapat dipakai titran lebih encer, atau jumlah
contoh disesuaikan. Hasil dapat dinyatakan dalam
volume titran yang dipakai atau dalam kesetaraan volume
kalium hidroksida 0,1 N atau natrium hidroksida 0,1 N.
Jika minyak telah dijenuhkan dengan karbon dioksida
untuk tujuan pengawetan, refluks perlahan-lahan
larutan etanol-eter selama 10 menit sebelum titrasi.
Minyak juga dapat dibebaskan dari karbon dioksida
dengan menempatkannya pada cawan dangkal di
dalam desikator vakum selama 24 jam sebelum
contoh ditimbang.
Metode II
procedure Buat 125 ml campuran sama banyak
isopropanol P dan toluen P. Sebelum dipakai ,
tambahkan 2 ml larutan fenolftalein P 1% dalam
isopropanol P dan netralkan dengan basa sampai
berwarna merah muda lemah. Timbang saksama beberapa
contoh cair, yang telah tercampur baik, seperti tertera
pada tabel di bawah ini dan larutkan dalam campuran
larutan yang sudah dinetralkan. Bila contoh tidak larut
dalam pelarut dingin, hubungkan labu dengan
pendingin yang sesuai dan hangatkan perlahan-lahan,
sambil sering dikocok sampai contoh larut. Kocok kuat
selama titrasi dengan kalium hidroksida 0,1 N LV atau
natrium hidroksida 0,1 N LV sampai berwarna merah
muda dengan intensitas yang sama dengan pelarut yang
sudah dinetralkan. Hitung jumlah asam lemak seperti
tertera pada Metode I.
Bilangan Asam Bobot contoh (g)
0 - 1 20
1 - 4
4 - 15
15 - 74,9
75,0
10
2,5
0,5
0,1
Bilangan Ester
Bilangan ester yaitu jumlah mg kalium hidroksida yang
diperlukan untuk menyabunkan ester dalam 1,0 g zat.
Jika Bilangan penyabunan dan Bilangan asam telah
ditetapkan, selisih antara keduanya menampilkan
Bilangan ester, Bilangan ester = Bilangan penyabunan –
Bilangan asam.
procedure Timbang saksama beberapa 1,5 - 2 g zat
dalam labu 250 ml yang telah ditara, tambahkan 20 ml
sampai 30 ml etanol P yang telah dinetralkan, kocok.
Tambahkan 1 ml fenolftalein LP, dan titrasi dengan
kalium hidroksida-etanol 0,5 N LV sampai asam bebas
dinetralkan. Tambahkan 25,0 ml kalium hidroksida-
etanol 0,5 N LV, lakukan seperti tertera pada Bilangan
penyabunan mulai dengan "Panaskan labu ..." dan
penambahan fenolftalein LP dapat diabaikan. Hitung
Bilangan ester dengan rumus :
( )BT VV
W
N11,56
56,11 yaitu bobot molekul kalium hidroksida; VT dan
VB berturut-turut yaitu volume dalam ml dari asam
klorida 0,5 N yang diperlukan dalam penetapan contoh
dan penetapan blangko; N yaitu normalitas larutan
asam klorida; W yaitu bobot dalam g zat yang
dipakai .
Bilangan Hidroksil
Bilangan Hidroksil yaitu jumlah mg kalium
hidroksida yang setara dengan kandungan hidroksil dalam
1,0 g zat.
Pereaksi piridina-anhidrida asetat Buat campuran
segar, 3 bagian volume piridina P yang baru dibuka atau
baru didestilasi dengan 1 bagian volume anhidrida asetat
P yang baru dibuka atau baru didestilasi.
procedure Timbang saksama beberapa zat sesuai
dengan tabel di bawah ini, masukkan ke dalam labu
Erlenmeyer bersumbat kaca 250 ml, dan tambahkan
5,0 ml Pereaksi piridina-anhidrida asetat. Masukkan
5,0 ml Pereaksi piridina-anhidrida asetat, sebagai
blangko ke dalam labu Erlenmeyer bersumbat kaca 250 ml
kedua. Hubungkan kedua labu dengan pendingin refluks
dengan sambungan asah yang sesuai, panaskan di atas
tangas uap selama 1 jam, pada masing-masing labu
tambahkan 10 ml air melalui pendingin, dan
panaskan lagi di atas tangas uap selama 10 menit.
Dinginkan, dan ke dalam masing-masing labu
tambahkan 25 ml butanol P, yang telah dinetralkan
terhadap fenolftalein LP dengan kalium hidroksida-etanol
0,5 N, dengan menuangkan 15 ml melalui masing-
masing pendingin dan sesudah pendingin dilepas, cuci
dinding kedua labu dengan 10 ml sisanya. Ke dalam
masing-masing labu tambahkan 1 ml fenolftalein LP, dan
titrasi dengan kalium hidroksida-etanol 0,5 N LV. Catat
volume dalam ml, yang diperlukan pada penetapan
larutan uji sebagai T dan yang diperlukan oleh blangko
sebagai B. Dalam labu Erlenmeyer 125 ml, campur
lebih kurang 10 g zat yang ditimbang saksama, dengan
10 ml piridina P yang baru didestilasi, dan telah
dinetralkan terhadap fenolftalein LP, tambahkan 1 ml
fenolftalein LP, dan titrasi dengan kalium hidroksida-
etanol 0,5 N LV, catat volume dalam ml, yang
dipakai oleh asam bebas dalam contoh sebagai A.
Hitung Bilangan hidroksil dengan rumus:
+ T
C
WAB
W
N11,56
- 1452 -
W dan C berturut-turut yaitu bobot dalam g zat yang
dipakai untuk asetilasi dan untuk penetapan asam
bebas; N yaitu normalitas kalium hidroksida-etanol;
56,11 yaitu bobot molekul kalium hidroksida. Jika
Bilangan asam dalam zat sudah diketahui, hitung
Bilangan hidroksil dengan rumus:
W yaitu bobot dalam g zat yang dipakai dalam
asetilasi; N yaitu normalitas kalium hidroksida-etanol;
56,11 yaitu bobot molekul kalium hidroksida.
Perkiraan bilangan hidroksil Bobot contoh (g)
0 sampai 20 10
20 sampai 50 5
50 sampai 100 3
100 sampai 150 2
150 sampai 200 1,5
200 sampai 250 1,25
250 sampai 300 1,0
300 sampai 350 0,75
Bilangan lodum
Bilangan lodum yaitu jumlah g iodum yang diserap
oleh 100 g zat, pada kondisi yang ditetapkan. Kecuali
dinyatakan lain dalam masing-masing monografi,
tetapkan Bilangan iodum dengan Metode I.
Metode I (Metode Hanus)
procedure Timbang saksama beberapa zat sesuai
dengan tabel di bawah ini, masukkan ke dalam labu
iodum 250 ml, larutkan dalam 10 ml kloroform P,
tambahkan 25,0 ml iodo-bromida LP, tutup rapat,
biarkan selama 30 menit di tempat terlindung cahaya,
dengan sesekali dikocok. Tambahkan berturut-turut 30
ml kalium iodida LP dan 100 ml air, dan titrasi iodum
yang dibebaskan dengan natrium tiosulfat 0,1 N LV,
kocok kuat-kuat sesudah setiap penambahan tiosulfat.
Bila warna iodum menjadi agak pucat, tambahkan 3 ml
kanji LP, dan lanjutkan titrasi dengan natrium tiosulfat
0,1 N LV sampai warna biru hilang. Lakukan penetapan
blangko. Hitung Bilangan iodum dengan rumus:
126,9 yaitu bobot atom Iodum, VB dan VS berturut-turut
yaitu volume natrium tiosulfat 0,1 N LV yang
dipakai untuk penetapan blangko dan penetapan
contoh, dalam ml; N yaitu normalitas kalium
hidroksida-etanol; W yaitu bobot contoh yang
dipakai , dalam g.
[Catatan Bila lebih dari setengah iodobromida LP
diserap oleh contoh, ulangi penetapan dengan
memakai contoh dalam jumlah lebih kecil.]
Bobot Sampel
Perkiraan bilangan Iodum Bobot dalam g, ± 0,1
< 5 3,0
5 - 20 1,0
21 - 50 0,4
51 - 100 0,2
101 - 150 0,13
151 - 200 0,1
Metode II (Metode Wijs)
Larutan Kalium Iodida Timbang saksama lebih
kurang 10 g kalium iodida P masukkan ke dalam labu
tentukur 100-ml, larutkan dan encerkan dengan air
sampai tanda. Simpan dalam wadah terlindung cahaya.
Indikator Larutan Kanji Campur 1 g kanji larut P
dengan air agak dingin untuk membuat pasta.
Tambahkan air mendidih sampai dengan 100 ml sambil
diaduk. Campur dan dinginkan. pakailah hanya bagian
yang jernih.
procedure Lelehkan contoh, jika tidak dalam bentuk
cair. [Catatan Suhu selama pelelehan tidak boleh lebih
10° dari titik leleh zat.] Saring melalui dua buah kertas
saring untuk memisahkan cemaran padat dan sisa
lembab. Penyaringan dapat dilakukan dalam oven pada
100° namun harus selesai dalam 5 menit±30 detik. Contoh
harus benar-benar kering. Semua alat gelas harus benar-
benar bersih dan kering. sesudah penyaringan, filtrat
contoh dikondisikan pada suhu 68° - 71°±1° sebelum
ditimbang. sesudah suhu 68° - 71°±1° tercapai, contoh
segera ditimbang, masukkan ke dalam labu iodum 500-ml,
timbang saksama seperti tertera pada tabel. [Catatan
Penimbangan contoh harus sedemikian rupa sesampai
ada kelebihan iodoklorida LV 50% sampai 60%
dari jumlah yang ditambahkan, yang berarti, 100%
sampai 150% dari jumlah yang diabsorbsi.] Tambahkan
15 ml campuran segar sikloheksan P dan asam asetat
glasial P (1:1), dan aduk untuk melarutkan contoh.
Tambahkan 25 ml iodo klorida LP, tutup rapat dan
goyang sampai tercampur. Biarkan sampai suhu
mencapai 25°±5º, lindungi dari cahaya, dengan sesekali
dikocok, selama 1 - 2 jam, tergantung dari Bilangan
Iodum contoh; Bilangan Iodum kurang dari 150, 1 jam;
Bilangan Iodum kurang lebih sama atau lebih dari 150, 2
jam. lalu dalam waktu 3 menit sesudah waktu
reaksi yang ditentukan, tambahkan secara berturut-turut
20 ml Larutan kalium iodida dan 150 ml air bebas
karbondioksida P, campur. Dalam waktu 30 menit, titrasi
iodum yang dibebaskan dengan natrium tiosulfat 0,1 N
LV sambil diaduk secara mekanik setiap penambahan
tiosulfat. Ketika warna kuning iodum hampir hilang,
tambahkan 1 - 2 ml Indikator larutan kanji, dan
lanjutkan titrasi sampai warna biru hilang. Lakukan
titrasi blangko. Hitung Bilangan iodum dengan rumus
yang sama pada perhitungan Metode I.
- 1453 -
Bilangan Peroksida
Bilangan Peroksida yaitu jumlah yang menampilkan ,
dalam miliekivalen, oksigen aktif, yaitu jumlah peroksida
yang terkandung dalam 1000 g zat [Catatan Uji harus
segera dilakukan sesudah sampling untuk mencegah
oksidasi dari zat yang diuji.]
procedure Jika tidak dinyatakan lain, timbang saksama
lebih kurang 5 g zat ke dalam labu Erlenmeyer bersumbat
kaca 250 ml. Tambahkan 30 ml campuran asam asetat
glasial P dan kloroform P (3:2), kocok untuk melarutkan,
dan tambahkan 0,5 ml larutan jenuh kalium iodida P.
Kocok selama 1 menit tepat dan tambahkan 30 ml air.
Titrasi dengan natrium tiosulfat 0,01 N LV secara
perlahan dengan pengocokan terus menerus sampai warna
kuning hampir hilang. Tambahkan 5 ml Indikator larutan
kanji LP, dan lanjutkan titrasi dengan pengocokan kuat
sampai warna biru hilang. Lakukan penetapan blangko.
[Catatan Volume titran yang dipakai untuk blangko
tidak lebih dari 0,1 ml.] Hitung Bilangan peroksida
dengan rumus:
VT dan VB berturut-turut yaitu volume dalam ml natrium
tiosulfat 0,01 N LV yang dipakai untuk penetapan
contoh dan penetapan blangko; N yaitu normalitas
natrium tiosulfat; W yaitu bobot contoh yang dipakai
dalam g.
Bilangan Penyabunan
Bilangan Penyabunan yaitu jumlah mg kalium hidroksida
yang diperlukan untuk menetralkan asam lemak bebas dan
menyabunkan ester yang terkandung dalam 1,0 g zat.
procedure Timbang saksama 1,5 g sampai 2 g zat, dalam
labu 250 ml yang telah ditara dan tambahkan 25,0 ml
kalium hidroksida-etanol 0,5 N LV. Panaskan labu diatas
tangas uap, refluks dengan pendingin yang sesuai, selama
30 menit, sambil sering diputar. [Catatan Waktu refluks
bisa mencapai 90 menit untuk memastikan sempurnanya
proses penyabunan, tergantung dari tipe ester yang
ditetapkan.] lalu tambahkan 1 ml fenolftalein LP,
dan titrasi kelebihan kalium hidroksida dengan asam
klorida 0,5 N LV. Lakukan penetapan blangko. Titrasi
dapat juga dilakukan dengan titrasi potensiometri. Hitung
Bilangan penyabunan dengan rumus:
56,11 yaitu bobot molekul kalium hidroksida; VT dan
VB berturut-turut yaitu volume dalam ml asam klorida
0,5 N LV yang dipakai dalam penetapan contoh dan
penetapan blangko; N yaitu normalitas asam klorida; W
yaitu bobot contoh yang dipakai dalam g.
Jika minyak telah dijenuhkan dengan karbondioksida
dengan tujuan pengawetan, tempatkan minyak ini
pada cawan dangkal dalam desikator vakum selama
24 jam sebelum contoh ditimbang.
Zat Tak Tersabunkan
Zat tak tersabunkan dalam minyak atau lemak yaitu
zat yang tidak tersabunkan oleh alkali hidroksida, namun
larut dalam pelarut umum lemak, dan hasil penyabunan
yang larut dalam pelarut ini .
procedure Timbang saksama 5,0 g minyak atau lemak
dalam labu Erlenmeyer 250 ml, tambahkan 50 ml larutan
kalium hidroksida-etanol yang dibuat dari 12 g kalium
hidroksida P dalam 10 ml air, dan encerkan dengan
etanol sampai 100 ml, refluks di atas tangas uap, selama
1 jam, kocok secara berkala. Dinginkan sampai suhu
dibawah 25º, pindahkan larutan ke dalam corong pisah
dengan kran terbuat dari politetrafluoroetilena, bilas labu
dua kali, tiap kali dengan 50 ml air yang dimasukkan ke
dalam corong pisah (jangan pakailah lemak pada kran).
Ekstraksi tiga kali, tiap kali dengan 100 ml eter P,
masukkan kumpulan ekstrak eter ke dalam corong pisah
lain yang berisi 40 ml air. Putar perlahan atau kocok
corong pisah selama beberapa menit. [Catatan
Pengocokan keras menyebabkan terbentuk emulsi yang
sukar dipisahkan.] Biarkan campuran memisah dan
buang lapisan bawah fasa air. Cuci ekstrak eter sebanyak
dua kali, tiap kali dengan 40 ml air, dan buang lapisan
bawah fasa air. Cuci ekstrak eter berturut-turut dengan 40
ml larutan kalium hidroksida P (3 dalam 100) dan 40 ml
air. Ulangi pencucian memakai larutan kalium
hidroksida-air sebanyak tiga kali. Cuci kembali
kumpulan ekstrak dengan 40 ml air sampai cucian
terakhir tidak memberi warna merah pada
penambahan 2 tetes fenolftalein LP. Masukkan ekstrak
eter ke dalam gelas piala yang telah ditara, dan bilas
corong pisah dengan 10 ml eter P, tambahkan bilasan ke
dalam gelas piala. Uapkan eter di atas tangas uap sampai
hampir kering, dan tambahkan 6 ml aseton P pada residu.
Uapkan aseton dengan udara mengalir dan keringkan
residu pada suhu 105° sampai antar penimbangan
berbeda tidak lebih dari 1 mg.. Hitung persentase dari zat
tak tersabunkan dalam minyak atau lemak dengan rumus
:
100
S
R
W
W
WR yaitu bobot, dalam g, residu; WS yaitu bobot,
dalam g, minyak atau lemak dari zat uji.
Larutkan residu dalam 20 ml etanol P, yang telah
dinetralkan terhadap fenolftalein LP, tambahkan
fenolftalein LP dan titrasi dengan natrium hidroksida-
etanol 0,1N LV, sampai larutan berwarna merah muda
yang tetap selama tidak kurang dari 30 detik. Jika volume
natrium hidroksida-etanol 0,1 N LV yang diperlukan
untuk titrasi lebih dari 0,2 ml, pemisahan lapisan belum
lengkap; bobot residu tidak dapat dinyatakan sebagai zat
tak tersabunkan, dan pengujian harus diulang.
- 1454 -
Suhu Pemadatan Asam Lemak
Penyiapan asam lemak Panaskan 75 ml Larutan
gliserin-kalium hidroksida (dibuat dengan melarutkan
25 g kalium hidroksida P dalam 100 ml gliserin P) dalam
gelas piala 800 ml sampai suhu 150°, dan tambahkan
50 ml lemak yang telah dijernihkan, dan jika perlu
dilelehkan. Panaskan campuran selama 15 menit sambil
sering diaduk, namun hindarkan suhu lebih dari 150°.
Penyabunan sempurna bila campuran menjadi homogen,
tanpa ada partikel yang melekat pada meniskus gelas
piala. Pindahkan ke dalam gelas piala atau cawan 800 ml
berisi 500 ml air yang hampir mendidih, tambahkan
perlahan-lahan 50 ml asam sulfat P (3:1), dan panaskan
larutan, sambil sering diaduk, sampai asam lemak
memisah dengan baik sebagai lapisan jernih. Cuci
dengan air mendidih sampai bebas dari asam sulfat,
kumpulkan asam lemak dalam gelas piala kecil, letakkan
di atas tangas uap sampai air memisah dan asam lemak
jernih, saring dalam keadaan panas ke dalam gelas piala
kering, dan keringkan pada suhu 105° selama 20 menit.
Masukkan asam lemak hangat ke dalam wadah yang
sesuai, dan dinginkan dalam tangas es sampai membeku.
Uji kesempurnaan penyabunan Masukkan 3 ml asam
lemak yang telah kering ke dalam tabung reaksi, dan
tambahkan 15 ml etanol P. Panaskan larutan sampai
mendidih, dan tambahkan volume sama amonium
hidroksida 6 N. Diperoleh larutan jernih.
procedure pakailah alat yang sama seperti pada
Alat penetapan suhu beku dan lakukan penetapan seperti
tertera pada procedure dalam Penetapan Suhu Beku
<1101>, "suhu beku" dibaca sebagai "suhu pemadatan".
Suhu pemadatan asam lemak diperoleh
dari harga rata-rata tidak kurang dari empat pembacaan
berturut-turut titik tertinggi pada waktu suhu naik.
Komposisi Asam Lemak
Larutan baku Buat campuran ester sesuai dengan
komposisi kandungan ester pada masing-masing
monografi. Larutan baku dapat mengandung komponen
lain [Catatan Campuran ester tersedia secara
komersial.] Komposisi campuran yang tersedia secara
komersial yaitu sebagai berikut :
Persen Ester Asam Lemak
Panjang
Rantai
Karbon
Jumlah
Ikatan
Rangkap
1,0 metil miristat 14 0
4,0 metil palmitat 16 0
3,0 metil stearat 18 0
3,0 metil arakidat 20 0
3,0 metil behenat 22 0
3,0 metil lignoserat 24 0
45,0 metil oleat 18 1
15,0 metil linoleat 18 2
3,0 metil linolenat 18 3
20,0 metil erukat 22 1
Komposisi campuran lain yang tersedia secara komersial
yaitu sebagai berikut :
Persen Ester Asam Lemak
Panjang
Rantai
Karbon
Jumlah
Ikatan
Rangkap
7,0 metil kaprilat 8 0
5,0 metil kaprat 10 0
48,0 metil laurat 12 0
15,0 metil miristat 14 0
7,0 metil palmitat 16 0
3,0 metil stearat 18 0
12,0 metil oleat 18 1
3,0 metil linoleat 18 2
Larutan uji [Catatan Jika dalam contoh ada
asam lemak yang mengandung lebih dari 2 ikatan
rangkap, hilangkan udara dari labu memakai gas
nitrogen selama beberapa menit.] Timbang lebih kurang
100 mg contoh, masukkan ke dalam labu 50 ml yang
terhubung dengan refluks-kondesor pendingin yang
sesuai dan pengaduk magnet. Tambahkan 4 ml larutan
natrium hidroksida metanolik 0,5 N LP dan refluks
sampai letupan lemak hilang (biasanya 5 - 10 menit).
Tambahkan 5 ml larutan yang dibuat dari 14 g boron
trifluorida P dalam metanol P untuk membuat 100 ml,
goyang untuk mencampur dan refluks selama 2 menit.
Tambahkan 4 ml heptana untuk kromatografi P, melalui
kondensor dan refluks selama 1 menit. Dinginkan dan
pindahkan kondensor, tambahkan lebih kurang 15 ml
larutan natrium klorida P jenuh, kocok dan biarkan
lapisan memisah. Masukkan lapisan heptana ke dalam
labu yang sesuai melalui 0,1 g natrium sulfat anhidrat P
yang telah dibilas dengan heptana untuk kromatografi P.
Pipet 1 ml larutan ini ke dalam labu tentukur 10-ml,
encerkan dengan heptana untuk kromatografi P sampai
tanda.
Larutan kesesuaian sistem Timbang lebih kurang
20 mg masing-masing asam stearat, asam palmitat dan
asam oleat, masukkan ke dalam labu 25 ml yang
terhubung dengan refluks-kondensor pendingin yang
sesuai dan pengaduk magnet dan lakukan sesuai procedure
pada larutan uji, mulai dari “Tambahkan 5,0 ml larutan
yang dibuat dengan melarutkan”.
Sistem kromatografi Lakukan penetapan dengan cara
Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi
<931>. Kromatograf gas dilengkapi dengan detektor
ionisasi nyala yang dipertahankan pada suhu 260º, sistem
injeksi “splitless” dan kolom kapiler leburan silika 30 m
x 0,53 mm, yang dilapisi fasa G16 dengan ketebalan
1,0 μm. Pertahankan suhu kolom pada 70° selama
2 menit sesudah penyuntikan, lalu naikkan dengan
kecepatan 5º per menit sampai suhu 240º, pertahankan
selama 5 menit. Pertahankan suhu injektor lebih kurang
220º dan laju alir gas helium P lebih kurang 50 cm per
detik.
Suntikkan Larutan kesesuaian sistem dan rekam
kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera
pada procedure : waktu retensi relatif untuk metil palmitat,
metil stearat dan metil oleat berturut-turut lebih kurang
- 1455 -
0,87; 0,99 dan 1,0; resolusi, R, antara puncak metil stearat
dan metil oleat tidak kurang dari 1,5 dan simpangan baku
relatif dari repons puncak palmitat dan stearat pada
penyuntikan ulang tidak lebih dari 6,0%. Simpangan baku
relatif dari perbandingan respons puncak palmitat
terhadap stearat pada penyuntikan ulang tidak lebih dari
1,0%.
procedure Suntikkan secara terpisah beberapa volume
sama (lebih kurang 1 μl) Larutan baku dan Larutan uji ke
dalam kromatograf, rekam kromatogram dan ukur
respons puncak ester asam lemak dari kromatogram
Larutan uji dengan membandingkan waktu retensi
puncak dari kromatogram Larutan baku. Ukur luas
puncak dari semua puncak ester asam lemak
kromatogram Larutan uji. Hitung persentase dari masing-
masing komponen asam lemak dalam contoh dengan
rumus :
100
B
A
A yaitu respons puncak dari masing-masing komponen
ester asam lemak; B yaitu jumlah respons puncak dari
semua puncak, kecuali puncak pelarut dari kromatogram
Larutan uji.
Penetapan dan Profil Asam Lemak Omega-3
procedure berikut dipakai untuk penetapan asam
eikosapentaenoat (EPA) (C20:5 n-3), asam dokosa-
heksaenoat (DHA) (C22:6 n-3) dan total asam omega-3
yang diperoleh dari ikan, tanaman, atau sumber mikroba
dalam minyak mentah dan minyak terenkapsulasi.
Lindungi larutan dari cahaya, senyawa pengoksidasi,
katalis oksidasi dan udara.
Kandungan EPA dan DHA
Baku Pembanding Etil Ester Asam Dokosaheksanoat
BPFI; Etil Ester Asam Eikosapentanoat BPFI; Metil
Trikosanoat BPFI.
Larutan antioksidan Timbang saksama beberapa
tertentu butilat hidroksitoluen larutkan dalam 2,2,4-
trimetilpentana P untuk mendapatkan larutan dengan
kadar 0,05 mg per ml.
Larutan baku internal Timbang saksama beberapa
Metil Trikosanoat BPFI, masukkan dalam labu tentukur
yang sesuai. Larutkan dan encerkan dengan Larutan
antioksidan sampai diperoleh larutan dengan kadar lebih
kurang 7,0 mg per ml. [Catatan Lindungi larutan
terhadap penguapan selama pengujian.]
Perkiraan Jumlah
EPA + DHA
Jumlah contoh yang
ditimbang
30% - 50% 0,4 - 0,5 g
50% - 70% 0,3 g
70% - 80% 0,25 g
Larutan uji 1 (untuk trigliserida) Timbang saksama
lebih kurang beberapa contoh seperti tertera pada tabel
masukkan ke dalam labu tentukur 10-ml, larutkan dan
encerkan dengan Larutan antioksidan sampai tanda. Pipet
2 ml larutan ke dalam tabung reaksi, uapkan pelarut
dengan mengalirkan nitrogen P secara perlahan.
Tambahkan 1,5 ml natrium hidroksida P 2% dalam
metanol, tutup rapat dengan tutup politetrafluoroetilen,
campur, dan panaskan dalam tangas air selama 7 menit.
Dinginkan, tambahkan 2 ml larutan boron triklorida P
dalam metanol P (120 g dalam 1000 ml), alirkan nitrogen
P, tutup rapat, campur, dan panaskan dalam tangas air
selama 30 menit. Dinginkan sampai suhu 40° - 50°,
tambahkan 1 ml 2,2,4-trimetilpentana P, tutup, dan
campur memakai vortex atau kocok kuat selama
tidak kurang dari 30 detik. Segera tambahkan 5 ml larutan
natrium klorida P jenuh yang mengandung 1 bagian
natrium klorida dan 2 bagian air. [Catatan Kocok setiap
kali proses. Sebelum dipakai , pisahkan larutan dari
zat yang tidak larut, saring bila perlu.] Alirkan nitrogen
P, tutup, dan campur dengan vortex atau kocok kuat
selama tidak kurang dari 15 detik. Diamkan sampai
lapisan atas jernih, pindahkan ke tabung yang lain. Kocok
lapisan metanol sekali lagi dengan 1 ml 2,2,4-
trimetilpentana P, dan kumpulkan ekstrak 2,2,4-
trimetilpentana. Cuci kumpulan ekstrak 2 kali, masing-
masing dengan 1 ml air, dan keringkan melalui natrium
sulfat anhidrat P.
Larutan uji 2 (untuk trigliserida) Timbang saksama
lebih kurang beberapa sama contoh seperti yang
dipakai pada penyiapan Larutan uji 1, masukkan ke
dalam labu tentukur 10-ml, larutkan dan encerkan dengan
Larutan baku internal sampai tanda. Lakukan penyiapan
seperti pada Larutan uji 1, dimulai dengan “Pipet 2 ml
larutan ke dalam tabung reaksi”.
Larutan uji 3 (untuk etil ester) Timbang saksama
lebih kurang beberapa contoh seperti tertera pada tabel,
masukkan ke dalam labu tentukur 10-ml, larutkan dan
encerkan dengan Larutan baku internal sampai tanda.
Larutan uji 4 (untuk etil ester) Timbang saksama
lebih kurang beberapa sama contoh seperti yang
dipakai pada penyiapan Larutan uji 3, masukkan ke
dalam labu tentukur 10-ml, larutkan dan encerkan dengan
Larutan antioksidan sampai tanda.
Larutan baku 1 Timbang saksama lebih kurang 0,10 g
masing-masing Etil Ester Asam Dokosaheksanoat BPFI
dan Etil Ester Asam Eikosapentanoat BPFI dalam labu
tentukur 10-ml, larutkan dan encerkan dengan Larutan
baku internal sampai tanda.
Larutan baku 2 Pipet 2 ml Larutan baku 1 ke dalam
tabung reaksi, uapkan pelarut dengan mengalirkan
nitrogen P secara perlahan. Lakukan penyiapan seperti
pada Larutan uji 1, dimulai dengan “Tambahkan 1,5 ml
natrium hidroksida P”.
Larutan kesesuaian sistem 1 Timbang saksama lebih
kurang 0,30 g masing-masing metil palmitat, metil
stearat, metil arakidat dan metil behenat, masukkan ke
dalam labu tentukur 10-ml, larutkan dan encerkan dengan
Larutan antioksidan sampai tanda.
- 1456 -
Larutan kesesuaian sistem 2 Timbang saksama lebih
kurang 55 mg metil ester asam dokosaheksanoat dan
5 mg metil ester asam tetrakos-15-enoat (asam nervonat),
masukkan dalam labu tentukur 10-ml, larutkan dan
encerkan dengan Larutan antioksidan sampai tanda.
Sistem kromatografi Lakukan penetapan dengan cara
Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi
<931>. Kromatograf gas dilengkapi dengan detektor
ionisasi nyala dan kolom kapiler leburan silika 25 m x
0,25 mm, yang dilapisi fasa G16 dengan ketebalan
0,2 μm. Pertahankan suhu detektor dan injektor pada
270° dan 250º. Atur suhu awal kolom pada 170º selama
2 menit, lalu naikkan dengan kecepatan 3º per
menit sampai 240º, pertahankan selama 2,5 menit.
pakailah Helium P sebagai gas pembawa dengan
perbandingan split 1 : 200 dan laju alir lebih kurang 1 ml
per menit. [Catatan Jika dipakai sistem injeksi
splitless, larutan harus diencerkan 1 dalam 200.]
Suntikkan Larutan kesesuaian sistem 1 dan Larutan
kesesuaian sistem 2, rekam kromatogram dan ukur
respons puncak seperti tertera pada procedure : dengan
Larutan kesesuaian sistem 1, persen respons meningkat
berturut-turut; metil palmitat, metil stearat, metil
arakhidat, metil behenat; perbedaan persen respons antara
metil palmitat dan metil behenat kurang dari 2,0 unit
persen respons; dengan Larutan kesesuaian sistem 2,
resolusi, R, antara metil ester asam dokosaheksanoat dan
metil ester asam tetrakos-15-enoat tidak kurang dari 1,2.
[Catatan Berkaitan dengan persyaratan kesesuaian
sistem di atas, persyaratan berikut berlaku untuk analisa
trigliserida namun tidak berlaku untuk etil ester.] Untuk
trigliserida, lakukan kromatografi pada Larutan baku 1
dan Larutan baku 2, rekam kromatogram dan ukur
respons puncak seperti tertera pada procedure : efisiensi
derivatisasi untuk konversi dari asam lemak etil ester
menjadi asam lemak metil ester tidak kurang dari 90,0%
untuk masing-masing asam lemak (DHA dan EPA).
procedure Suntikkan secara terpisah masing-masing
dua kali dengan volume sama (lebih kurang 1 l) Larutan
baku 1, Larutan baku 2, Larutan uji 1 (untuk trigliserida),
Larutan uji 2 (untuk trigliserida), Larutan uji 3 (untuk etil
ester), dan Larutan uji 4 (untuk etil ester) ke dalam
kromatograf, rekam kromatogram dan ukur respons
puncak. Identifikasi waktu retensi puncak baku internal
untuk membandingkan kromatogram Larutan uji 3 dan
Larutan uji 4 (untuk etil ester). Hitung persentase EPA
dan DHA dalam trigliserida dengan rumus:
F
R
R
W
C
S
U 100
F yaitu faktor yang menggambarkan kandungan DHA
(F = 0,921) dan EPA (F = 0,915) sebagai asam lemak
bebas; C yaitu kadar, dalam mg per ml, DHA atau EPA
dalam Larutan baku 2; W yaitu bobot, dalam mg,
contoh yang dipakai dalam penyiapan Larutan uji 1;
RS yaitu perbandingan respons puncak dari EPA atau
DHA relatif terhadap baku internal pada kromatogram
Larutan baku 2; RU yaitu respons puncak terkoreksi dari
EPA atau DHA relatif terhadap baku internal pada
kromatogram Larutan uji 1. RU dihitung sebagai berikut:
2
1
1
2
2
T
T
U
T
U r
r
r
r
r
×
rU2 yaitu respons puncak baku internal kromatogram
pada Larutan uji 2; rU1 yaitu respons puncak yang
berada pada waktu retensi yang sama dengan baku
internal dari kromatogram Larutan uji 1; rT1 yaitu
respons puncak dari EPA atau DHA pada kromatogram
Larutan uji 1; dan rT2 yaitu respons puncak dari EPA
atau DHA pada kromatogram Larutan uji 2. Hitung
persentase etil ester dengan rumus:
F
R
R
W
C
S
U 100
F yaitu faktor yang menggambarkan kandungan DHA
(F = 0,921) dan EPA (F = 0,915) sebagai asam lemak
bebas; C yaitu kadar, dalam mg per ml, dari DHA atau
EPA dalam Larutan baku 1; W yaitu bobot, dalam mg,
contoh yang dipakai dalam penyiapan Larutan uji 3;
RS yaitu perbandingan respons puncak dari EPA atau
DHA relatif terhadap baku internal pada kromatogram
Larutan baku 1; RU yaitu respons puncak terkoreksi dari
EPA atau DHA relatif terhadap baku internal pada
kromatogram Larutan uji 3. RU dihitung sebagai berikut:
2
1
1
2
2
T
T
U
T
U r
r
r
r
r
×
rU2 yaitu respons puncak baku internal pada
kromatogram Larutan uji 3; rU1 yaitu respons puncak
yang berada di waktu retensi yang sama dengan baku
internal dari kromatogram Larutan uji 4; rT1 yaitu
respons puncak dari EPA atau DHA pada kromatogram
Larutan uji 4; dan rT2 yaitu respons puncak dari EPA
atau DHA pada kromatogram Larutan uji 3.
Kandungan Total Asam Omega-3
Hitung kandungan total asam omega-3 dengan rumus:
EPA + DHA + ((An – 3 x (EPA + DHA))/(AEPA + ADHA))
EPA yaitu kandungan dari EPA, dalam mg per g,
diperoleh dari uji Kandungan EPA dan DHA; DHA
yaitu kandungan dari DHA, dalam mg per g, diperoleh
dari uji Kandungan EPA dan DHA; An – 3 yaitu jumlah
respons puncak sesuai dengan jumlah rantai C18 : 3 n-3,
C18 : 4 n-3, C20 : 4 n-3, C21 : 5 n-3 dan C22 : 5 n-3
metil ester pada kromatogram Larutan uji 1 untuk
trigliserida atau sesuai dengan etil ester pada
kromatogram Larutan uji 3; AEPA yaitu respons puncak
sesuai dengan etil ester EPA pada kromatogram Larutan
uji 3 untuk etil ester; dan ADHA yaitu respons puncak
- 1457 -
sesuai dengan metil ester DHA pada kromatogram
Larutan uji 1 untuk trigliserida atau puncak sesuai dengan
etil ester DHA pada kromatogram Larutan uji 3.
Air dan Sedimen dalam Minyak Lemak
Alat Alat sentrifus, sebaiknya memiliki diameter
ayunan (d = jarak dari ujung ke ujung tabung berputar)
38 cm sampai 43 cm dan dijalankan pada kecepatan
lebih kurang 1500 rpm. Jika dipakai sentrifuga
dengan dimensi berbeda, hitung kecepatan putaran yang
diinginkan dengan rumus:
d
rpm 6,401500=
Tabung sentrifuga berbentuk buah pir, dengan sumbat
yang sesuai. Kapasitas total tiap tabung lebih kurang
125 ml. Pembagian skala jelas dan dapat dibedakan,
dengan pembacaan dari dasar tabung menurut skala
seperti tertera pada tabel berikut :
Volume (ml) Pembagian skala (ml)
0 sampai 3 0,1
3 sampai 5 0,5
5 sampai 10 1,0
10 sampai 25 5,0
25 sampai 50 25,0
50 sampai 100 50,0
procedure Masukkan masing-masing 50,0 ml benzen P
ke dalam 2 tabung sentrifuga, dan ke dalam tiap tabung
tambahkan 50,0 ml minyak, hangatkan jika perlu untuk
menggabungkan kembali stearin yang terpisah, dan
campur kuat-kuat pada suhu 25°. Tutup rapat tabung, dan
kocok kuat sampai isinya benar-benar tercampur, lalu
celupkan tabung ke dalam tangas air pada suhu 50° selama
10 menit. Sentrifus selama 10 menit. Baca volume
campuran air dan sedimen pada dasar tiap tabung. Sentrifus
berulang-ulang, setiap 10 menit sekali sampai volume
campuran air dan sedimen tetap konstan pada tiga kali
pembacaan berturut-turut. Jumlah volume campuran air
dan sedimen dalam kedua tabung menampilkan
persentase, dalam volume, dari air dan sedimen dalam
minyak.
Bilangan Anisidin
Bilangan anisidin yaitu 100 kali pengukuran
kerapatan optik dalam sel 1-cm dari larutan yang
mengandung 1 g zat dalam 100 ml campuran pelarut dan
pereaksi seperti pada metode berikut. [Catatan Lakukan
penetapan secepat mungkin untuk menghindarkan paparan
cahaya.]
Larutan uji A Larutkan 0,500 g zat dengan isooktan P,
encerkan sampai 25,0 ml.
Larutan uji B Pipet 5 ml Larutan uji A, tambahkan
1,0 ml larutan p-anisidin P 2,5 g per liter dalam asam
asetat glasial P, kocok, simpan terlindung cahaya.
Larutan baku Pipet 5 ml isooktan P, tambahkan
1,0 ml dari larutan p-anisidin P 2,5 g per liter dalam asam
asetat glasial P, kocok, simpan terlindung cahaya.
procedure Ukur serapan Larutan uji A pada 350 nm
memakai isooktan P sebagai blangko. Ukur serapan
Larutan uji B pada 350 nm tepat 10 menit sesudah
disiapkan, pakailah Larutan baku sebagai pembanding.
Hitung Bilangan anisidin dengan rumus:
AS yaitu serapan dari Larutan uji B pada 350 nm; Ab
yaitu serapan dari Larutan uji A pada 350 nm; m yaitu
bobot, dalam g, dari Larutan uji A.
Bilangan Total Oksidasi (Totox)
Bilangan total oksidasi dinyatakan dengan rumus:
2PV + AV
PV yaitu Bilangan Peroksida
AV yaitu Bilangan Anisidin
Cemaran Logam
Alat
Labu destruksi pakailah tabung politetrafluoroetilen
dengan volume lebih kurang 120 ml, dengan penutup
yang sesuai, berkatup untuk mengatur tekanan udara di
dalam wadah, dan tabung politetrafluoroetilen untuk
melepaskan gas.
Sistem Pastikan tabung kedap udara, pakailah tekanan
yang sama untuk masing-masing tabung.
Oven ”microwave” memiliki frekuensi magnet
pada 2450 MHz, dengan output 0 - 630±70 W dengan
peningkatan 1%, program komputer digital, dinding yang
dilapisi politetrafluoroetilen dengan “exhaust fan” yang
kecepatannya bervariasi, sistem rotasi, dan saluran
pembuangan untuk melepaskan gas.
Spektrofotometer Serapan Atom Merupakan
peralatan dengan lampu katoda-berongga sebagai sumber
radiasi dan lampu deuterium sebagai korektor latar
belakang; sistem terdiri dari:
Tungku Grafit sebagai alat atomisasi untuk kadmium,
tembaga, besi, timbal, nikel dan seng.
Sistem otomatis pembentukan aliran uap hidrida
berkesinambungan (“continuous-flow hydride vapor
generation”) untuk arsen dan raksa.
procedure Umum
Perhatian Standar keselamatan dan instruksi
pengoperasian alat labu destruksi tekanan tinggi dan
“microwave” harus diikuti sesuai procedure .
[Catatan Jika dipakai peralatan dengan spesifikasi
yang berbeda, perlu dilakukan penyesuaian terhadap
parameter peralatan.]
- 1458 -
Pencucian Cuci alat gelas dan perlengkapan
laboratorium dengan larutan asam nitrat P 10 mg per
ml sebelum dipakai .
Asam nitrat bebas cemaran logam Asam nitrat P
yang memenuhi persyaratan nilai maksimum arsen
(As), kadmium (Cd), tembaga (Cu), besi (Fe), raksa
(Hg), timbal (Pb), nikel (Ni) dan zink (Zn) berturut-
turut setara 0,005 bpj; 0,005 bpj; 0,001 bpj; 0,02 bpj;
0,002 bpj; 0,001 bpj; 0,005 bpj dan 0,01 bpj.
Asam klorida bebas cemaran logam Asam klorida
P yang memenuhi persyaratan nilai maksimum As, Cd,
Cu, Fe, Hg, Pb, Ni dan Zn berturut-turut setara 0,005
bpj; 0,003 bpj; 0,003 bpj; 0,05 bpj; 0,005 bpj; 0,001 bpj;
0,004 bpj dan 0,005 bpj.
Asam sulfat bebas cemaran logam Asam sulfat P
yang memenuhi persyaratan nilai maksimum As, Cd,
Cu, Fe, Hg, Pb, Ni dan Zn berturut-turut setara
0,005 bpj; 0,002 bpj; 0,001 bpj; 0,05 bpj; 0,005 bpj;
0,001 bpj; 0,002 bpj dan 0,005 bpj.
Larutan uji persediaan Timbang saksama lebih
kurang 0,5 g minyak lemak dalam labu destruksi,
seperti tertera pada masing-masing monografi.
Tambahkan 6 ml Asam nitrat bebas cemaran logam
dan 4 ml Asam klorida bebas cemaran logam. Sumbat
labu.
Tabel 1
Cd Cu Fe Pb Ni Zn
Panjang
gelombang (nm)
228,8 324,8 248,3 283,5 232 213,9
Celah (nm) 0,5 0,5 0,2 0,5 0,2 0,5
Arus lampu (mA) 6 7 5 5 10 7
Suhu pemijaran
(o)
800 800 800 800 800 800
Suhu atomisasi
(o)
1800 2300 2300 2200 2500 2000
Koreksi latar
belakang
on Off off off off off
Aliran nitrogen
(liter per menit)
3 3 3 3 3 3
Larutan blangko persediaan Campur 6 ml Asam
nitrat bebas cemaran logam dan 4 ml Asam klorida
bebas cemaran logam ke dalam labu destruksi.
Larutan uji 1 Masukkan labu destruksi yang berisi
Larutan uji persediaan ke dalam oven “microwave”.
Destruksi dengan tiga tahap proses berikut: energi 80%
selama 15 menit, energi 100% selama 5 menit dan
energi 80% selama 20 menit.
sesudah selesai proses destruksi biarkan labu menjadi
dingin. Tambahkan 4 ml Asam sulfat bebas cemaran
logam P. Ulangi proses destruksi, biarkan labu menjadi
dingin sampai suhu kamar. Buka labu destruksi dan
pindahkan larutan jernih dan tidak berwarna yang
diperoleh ke dalam labu tentukur 50-ml. Bilas labu
destruksi dua kali masing-masing dengan 15 ml air dan
masukkan air bilasan ke dalam labu tentukur ini .
Tambahkan 1,0 ml larutan magnesium nitrat P 10 mg
per ml dan 1,0 ml larutan amonium dihidrogen fosfat P
100 mg per ml ke dalam labu. Encerkan dengan air
sampai tanda dan campur.
Larutan blangko 1 Masukkan labu destruksi berisi
Larutan blangko persediaan ke dalam oven
“microwave”. Lakukan procedure seperti tertera pada
Larutan uji 1 mulai dari “Destruksi dengan tiga tahap
proses berikut”.
Kalibrasi langsung [Catatan Kadar larutan baku
tergantung dari kandungan logam dari contoh uji.]
Untuk pengukuran rutin, diperlukan tiga larutan baku,
Larutan blangko 1 dan Larutan uji 1.
pakailah Larutan uji 1 dan Larutan blangko 1
seperti ini di atas atau sesuai dengan monografi.
Buat tidak kurang dari tiga larutan baku yang
mengandung semua elemen logam yang akan diuji.
Nilai serapan Larutan uji 1 yang diperoleh untuk
masing-masing elemen logam harus berada dalam
rentang kalibrasi. Semua pereaksi yang dipakai
dalam pembuatan Larutan uji 1 ditambahkan dengan
kadar yang sama dengan larutan baku.
Ukur serapan masing-masing larutan dengan
Spektrofotometer Serapan Atom dengan jumlah
pengulangan yang sama untuk memperoleh pembacaan
yang stabil.
Buat kurva kalibrasi dari nilai rata-rata hasil
pembacaan Larutan uji 1 sebagai fungsi kadar larutan
baku. Hitung kadar elemen dalam Larutan uji 1 yang
dihitung terhadap kurva yang diperoleh.
Penambahan baku Masukkan beberapa sama
Larutan uji 1 yang dibuat sesuai dengan procedure di
atas atau sesuai dengan monografi ke dalam empat
buah labu tentukur. Tambahkan larutan baku dengan
kadar elemen uji yang diketahui ke dalam masing-
masing labu dengan volume bertingkat sesampai
diperoleh larutan dengan kadar elemen uji yang menaik
untuk mendapatkan kurva dengan respons yang linear.
Labu tanpa penambahan larutan baku ditandai sebagai
larutan uji.
Ukur serapan masing-masing larutan memakai
Spektrofotometer Serapan Atom, lakukan pengulangan
pengukuran yang sama untuk masing-masing larutan
untuk mendapatkan hasil pembacaan yang stabil.
Buat kurva antara serapan larutan baku elemen uji
terhadap kadar elemen uji. Ekstrapolasikan garis pada
kurva sampai memotong sumbu x. Jarak antara titik
perpotongan ini dengan titik nol merupakan kadar
elemen uji dalam larutan uji.
Uji Spesifik
KADNIUM (Cd), TEMBAGA (Cu), BESI (Fe),
TIMBAL (Pb), NIKEL (Ni) DAN ZINK (Zn)
Larutan baku persediaan Buat larutan dengan
kadar 5 μg per ml dari masing-masing elemen uji.
Larutan baku Masukkan masing-masing 10 μl,
20 μl dan 40 μl Larutan baku persediaan ke dalam tiga
buah labu tentukur 10-ml. Ke dalam masing-masing
labu, tambahkan 0,1 ml larutan magnesium nitrat P 10
mg per ml; 0,1 ml larutan amonium dihidrogen fosfat P
100 mg per ml; 0,6 ml Asam nitrat bebas cemaran
logam; 0,4 ml Asam klorida bebas cemaran logam dan
- 1459 -
0,4 ml Asam sulfat bebas cemaran logam, campur.
Tambahkan 5,0 ml Larutan uji 1 ke dalam masing-
masing labu, encerkan dengan air sampai tanda,
campur.
Larutan uji 2 Masukkan ke dalam labu tentukur
10-ml: 0,1 ml larutan magnesium nitrat P 10 mg per
ml; 0,1 ml larutan amonium dihidrogen fosfat P 100 mg
per ml; 0,6 ml Asam nitrat bebas cemaran logam;
0,4 ml Asam klorida bebas cemaran logam dan 0,4 ml
Asam sulfat bebas cemaran logam, campur.
Tambahkan 5,0 ml Larutan uji 1, encerkan dengan air
sampai tanda, campur.
Larutan blangko 2 Masukkan ke dalam labu
tentukur 10-ml: 0,1 ml larutan magnesium nitrat P
10 mg per ml; 0,1 ml larutan amonium dihidrogen
fosfat P 100 mg per ml; 0,6 ml Asam nitrat bebas
cemaran logam; 0,4 ml Asam klorida bebas cemaran
logam dan 0,4 ml Asam sulfat bebas cemaran logam,
campur. Tambahkan 5,0 ml Larutan blangko 1,
encerkan dengan air sampai tanda, campur.
procedure Ukur kandungan Cd, Cu, Fe, Pb, Ni dan
Zn memakai Spektrofotometer Serapan Atom
dengan tungku grafit yang sesuai. Dalam waktu
berurutan, ukur serapan Larutan blangko 1, Larutan
baku dan Larutan uji 2 masing-masing tidak kurang
dari tiga kali pengukuran. Nilai serapan Larutan
blangko 2 sebagai koreksi dari nilai serapan Larutan
baku dan Larutan uji 2. Lakukan seperti pada procedure
Penambahan baku dalam metode procedure umum di
atas. Parameter alat yang dapat dipakai seperti
tertera pada Tabel 1.
ARSEN (As) DAN RAKSA (Hg)
Ukur kandungan arsen dan raksa terhadap larutan
baku arsen atau raksa pada kadar yang diketahui
memakai metode Kalibrasi langsung pada
procedure umum di atas, dengan sistem otomatis
pembentukan aliran uap hidrida berkesinambungan.
Untuk pengujian batas spesifikasi arsen 1 bpj dan
raksa 1 bpj, buat tiga larutan baku kerja dengan kadar
5 ng per ml, 10 ng per ml dan 20 ng per ml untuk
masing-masing elemen uji.
Nilai serapan larutan blangko secara otomatis sebagai
koreksi nilai serapan larutan uji.
Arsen
Larutan blangko 3 Tambahkan 1,0 ml larutan Kalium
iodida P 200 mg per ml ke dalam 19,0 ml Larutan
blangko 1. Biarkan larutan pada suhu ruang selama
50 menit atau pada suhu 70º selama 4 menit.
Larutan uji 3 Tambahkan 1,0 ml larutan Kalium
iodida P 200 mg per ml ke dalam 19,0 ml Larutan uji 1.
Biarkan larutan pada suhu ruang selama 50 menit atau
pada suhu 70º selama 4 menit.
Pereaksi asam 1 Asam klorida bebas cemaran logam.
Pereaksi pereduksi Larutan natrium tetrahidroborat P
6 mg per ml dalam natrium hidroksida P 5 mg per ml.
Parameter alat dapat dipakai seperti tertera pada
Tabel 2.
Raksa
Larutan blangko 4 Lakukan seperti pada Larutan
blangko 3.
Larutan uji 4 Lakukan seperti pada Larutan uji 3.
Pereaksi asam 2 Asam klorida bebas cemaran logam
515 mg per ml.
Pereaksi pereduksi 2 Larutan timah(II) klorida P
10 mg per ml dalam Asam klorida bebas cemaran logam
200 mg per ml.
Parameter alat dapat dipakai seperti tertera pada
Tabel 2.
Tabel 2
As Hg
Panjang gelombang (nm) 193,7 253,7
Lebar celah (nm) 0,2 0,5
Arus lampu (mA) 10 4
Laju alir pereaksi asam (ml
per menit)
1,0 1,0
Laju alir pereaksi pereduksi
(ml per menit)
1,0 1,0
Laju alir larutan blangko,
baku, uji (ml per menit)
7,0 7,0
sel absorpsi kuarsa
(dipanaskan)
kuarsa
(tidak
dipanaskan)
Koreksi latar belakang off off
Laju alir nitrogen (liter per
menit)
0,1 0,1
KOMPOSISI STEROL
Pemisahan Fraksi Sterol
Larutan pembanding A Timbang saksama
beberapa kolesterol dan larutkan dalam kloroform P
sampai kadar 5% (b/v).
Larutan uji A Timbang saksama lebih kurang 5 g
contoh uji dalam labu 250 ml. Tambahkan 50 ml
kalium hidroksida-etanol 2 N, refluks secara perlahan
dengan pengocokan kuat sampai terjadi penyabunan
(larutan menjadi jernih). Lanjutkan pemanasan selama
20 menit, tambahkan 50 ml air dari atas kondensor.
Dinginkan sampai suhu 30º. Pindahkan larutan ke dalam
corong pisah 500 ml, bilas labu dengan air sampai
volume kurang lebih 50 ml. Tambahkan lebih kurang
80 ml eter P, kocok kuat selama 30 detik dan biarkan
memisah. [Catatan Emulsi dapat dihilangkan dengan
menambahkan sedikit etanol atau methanol.] Pisahkan
lapisan bawah fasa air dan kumpulkan ke dalam corong
pisah yang lain. Lakukan ekstraksi kembali sebanyak dua
kali pada tahap air-etanol, memakai 60 - 70 ml eter P
pada tiap kali ekstraksi. Kumpulkan ekstrak eter ke
dalam corong pisah, cuci dengan air tiap kali 50 ml,
sampai air pencuci tidak bersifat basa terhadap
fenolftalein LP. Saring fasa eter melalui natrium sulfat
anhidrat P ke dalam labu 250 ml yang sudah ditara, cuci
corong dan kertas saring dengan sedikit eter P. Destilasi
eter sampai menjadi beberapa ml, keringkan dengan
pengering hampa udara atau dengan aliran nitrogen P.
Sempurnakan pengeringan pada suhu 100º selama
kurang lebih 15 menit, dinginkan dalam desikator dan
- 1460 -
timbang. Larutkan zat tidak tersabunkan dalam
kloroform P sampai diperoleh larutan dengan kadar lebih
kurang 5%.
Larutan uji B Timbang 5 g minyak kanola dan
lakukan seperti pada Larutan uji A, mulai dari
“Tambahkan 50 ml kalium hidroksida-etanol 2 N”.
Larutan uji C Timbang 5 g minyak biji bunga
matahari dan lakukan seperti pada Larutan uji A, mulai
dari “Tambahkan 50 ml kalium hidroksida-etanol 2 N”.
procedure Lakukan Kromatografi lapis tipis seperti
tertera pada Kromatografi <931>.
tahap gerak Buat campuran toluen P dan aseton P (95 :
5) atau campuran heksana P dan eter P (65 : 35).
Masukkan campuran dalam bejana kromatografi sampai
tinggi larutan lebih kurang 1 cm. Tutup bejana dengan
penutup yang sesuai, biarkan selama kurang lebih 30
menit. Garis penanda pada kertas saring yang dicelupkan
ke dalam larutan dapat ditempatkan pada dinding dalam
bejana. [Catatan Campuran tahap gerak sebaiknya
diganti setiap kali pengujian untuk menjamin
reprodusibilitas kondisi eluasi.]
Penjerap Campuran silika gel P dengan ukuran
partikel 5 - 17 μm dan ketebalan lapisan 200 μm pada
lempeng poliester 20 cm x 20 cm.
procedure Rendam Penjerap dalam kalium hidroksida-
etanol 0,2 N selama 10 detik, keringkan dalam lemari
asam selama 2 jam dan panaskan pada suhu 100º selama
1 jam. [Catatan Pindahkan dari alat pemanas tervalidasi
dan simpan lempeng dalam desikator sampai waktunya
dipakai . Lempeng harus dipakai dalam rentang
waktu 15 hari. Lempeng kromatografi lapis tipis tanpa
pengkondisian awal juga tersedia secara komersial.]
pakailah lempeng terpisah untuk masing-masing larutan
uji.
Totolkan 0,3 ml Larutan uji A lebih kurang 2 cm dari
tepi bawah dengan ukuran bercak sekecil mungkin dan
sama untuk masing-masing bercak. Sejajar dengan
bercak ini , totolkan 2 sampai 3 μl Larutan
pembanding A pada ujung lempeng. Masukkan lempeng
dalam bejana kromatografi berisi tahap gerak, biarkan
merambat sampai mencapai lebih kurang 1 cm dari ujung
atas lempeng. Angkat lempeng, tandai batas rambat,
keringkan pada aliran udara panas [Catatan Hindarkan
panas yang berlebihan.] atau dengan cara menempatkan
lempeng dalam lemari asam. Semprot lempeng dengan
2,7-diklorofluoresin P 0,2% dalam etanol P dan amati di
bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm.
[Catatan Lempeng yang dilapisi senyawa indikator UV
juga tersedia secara komersial dengan tujuan
pemakaian yang sama.] Pada masing-masing lempeng,
tandai pita sterol yang sejajar dengan bercak Larutan
pembanding A, termasuk pada daerah 2 - 3 mm di atas
dan di bawah bercak yang sejajar dengan bercak Larutan
pembanding A. Pindahkan silika gel pada bagian yang
ada bercak ke atas penyaring kaca masir dengan
septum berpori G3. Tambahkan 10 ml kloroform P
panas, campur hati-hati dengan spatula logam, saring di
bawah kondisi hampa udara, kumpulkan filtrat dalam
labu yang dihubungkan dengan penyaring. Cuci residu
dalam penyaring tiga kali masing-masing dengan 10 ml
eter P dan kumpulkan filtrat dalam labu yang sama.
Uapkan filtrat sampai volume 4 - 5 ml, pindahkan larutan
residu ke dalam tabung uji berujung runcing dan bertutup
ulir yang sebelumnya sudah ditimbang, uapkan sampai
kering dengan pemanasan perlahan melalui aliran
nitrogen P. Larutkan residu dengan beberapa tetes aseton
P dan uapkan kembali sampai kering
.jpg)
