. Panaskan pada
suhu 105º selama lebih kurang 10 menit, dinginkan
dalam desikator dan timbang.
Perlakukan Larutan uji B dan Larutan uji C sama
seperti Larutan uji A.
Penetapan Sterol
Larutan Uji D Ke dalam tabung uji yang
mengandung fraksi sterol yang telah dipisahkan dari
contoh uji memakai kromatografi lapis tipis,
tambahkan campuran piridin anhidrat P,
heksametildisilazan P dan klorotrimetilsilan P (9:3:1)
yang dibuat segar dengan perbandingan 50 μl untuk tiap
mg sterol, hindarkan kondisi lembab. Sumbat tabung
dengan rapat dan kocok hati-hati sampai sterol larut
sempurna. Biarkan pada suhu ruang selama 15 menit dan
sentrifugasi selama beberapa menit jika perlu. pakailah
beningan. [Catatan Kekeruhan tipis yang terbentuk
yaitu normal dan tidak menyebabkan anomali. namun
jika terbentuknya endapan putih keras atau terjadi
warna merah muda menampilkan adanya kelembaban
atau kerusakan pereaksi. Jika hal ini terjadi, pengujian
harus diulang.]
Larutan pembanding E Ke dalam 9 bagian sterol
yang dipisahkan dari minyak kanola dengan
kromatografi lapis tipis, tambahkan 1 bagian kolesterol.
Lakukan yang sama seperti pada pembuatan Larutan uji D.
Larutan pembanding F Lakukan pemisahan sterol
dari minyak biji bunga matahari dengan kromatografi
lapis tipis. Perlakukan sama seperti Larutan uji D.
Sistem kromatografi Lakukan penetapan dengan
Kromatografi gas seperti tertera pada Kromatografi
<931>. Kromatograf gas dilengkapi dengan detektor
ionisasi nyala dan kolom kaca atau leburan silika 0,25
sampai 0,32 mm x 20 sampai 30 m, yang dilapisi fasa
diam G27 atau G36 dengan ketebalan 0,10 sampai
0,30 μm. Pertahankan suhu injektor, detektor dan kolom
berturut-turut pada 280°, 290º dan 260°±5º. pakailah
helium P sebagai gas pembawa dengan kecepatan alir
20 - 35 cm per detik atau hidrogen P dengan kecepatan
alir 30 sampai 50 cm per detik. Perbandingan celah 1:50
sampai 1 : 100. Suntikkan Larutan pembanding E dan
Larutan pembanding F, rekam kromatogram dan ukur
respons puncak seperti tertera pada procedure : waktu
retensi -sitosterol 20±5 menit dan semua puncak sterol
yang ada terpisah. Kromatogram dari Larutan
pembanding E menampilkan empat puncak spesifik
kolesterol, brassikasterol, kampesterol dan -sitosterol;
kromatogram dari Larutan pembanding F menampilkan
empat puncak spesifik kampesterol, stigmasterol,
-sitosterol dan 7- stigmasterol. Waktu retensi untuk
sterol dengan pembanding -sitosterol tertera pada Tabel 3.
- 1461 -
Tabel 3. Waktu Retensi Relatif Sterol dengan Dua
Kolom yang Berbeda
Identifikasi Kolom G36 Kolom G27
Kolesterol 0,67 0,63
Brassikasterol 0,73 0,71
24-Metilen-kolesterol 0,82 0,80
Kampesterol 0,83 0,81
Kampestanol 0,85 0,82
Stigmasterol 0,88 0,87
7-Kampesterol 0,93 0,92
5,23-Stigmastadienol 0,95 0,95
Klerosterol 0,96 0,96
-Sitosterol 1,00 1,00
Sitostanol 1,02 1,02
5-Avenasterol 1,03 1,03
5, 24-
Stigmastadienol
1,08 1,08
7-Stigmastenol 1,12 1,12
7- Avenasterol 1,16 1,16
procedure Suntikkan secara terpisah dengan volume
sama (lebih kurang 1 l) Larutan uji D, Larutan
pembanding E dan Larutan pembanding F, rekam
kromatogram dan ukur respons puncak dari sterol. Hitung
persentase dari masing-masing sterol dalam fraksi sterol
contoh uji dengan rumus:
100
S
A
A yaitu respons puncak komponen sterol dari contoh
dan S yaitu jumlah respons puncak komponen yang
tertera dalam Tabel 3.
PEMBAKARAN DENGAN LABU OKSIGEN <501>
procedure pembakaran dengan labu oksigen merupakan
langkah persiapan penetapan Brom, Klor, Iodum,
Selenium dan Belerang dalam bahan obat. Pembakaran
zat uji (biasanya senyawa organik) menghasilkan
senyawa anorganik yang larut dalam air, yang dianalisa
untuk unsur khusus menurut cara yang tertera dalam
monografi atau menurut pengujian umum dalam
lampiran.
Peringatan yang diberikan pada procedure sebagai
tindakan pengamanan minimum dan ditekankan perlunya
tindakan yang sangat hati-hati selama bekerja.
Alat Terdiri dari labu Erlenmeyer 500 ml berdinding
tebal atau labu yang lebih besar, bagian atas seperti
mangkuk, dilengkapi dengan sumbat yang terbuat dari
kaca asah, dengan pembawa zat uji, yang terdiri dari
kawat platina tebal dan kuat dan sepotong kasa platina
yang dilas, berukuran 2 cm x 1,5 cm.
procedure [Perhatikan pakailah kaca mata pengaman
dan pakailah perisai pengaman selama penetapan. Labu
harus benar-benar bersih dan bebas dari pelarut
organik.] Jika zat yang diuji padat, timbang zat di atas
kertas saring bebas halida berukuran lebih kurang 4 cm2,
dan lipat kertas untuk membungkus zat. Jika zat yang
diuji cairan, timbang dalam kapsul yang telah ditara;
kapsul selulosa asetat dipakai untuk cairan dengan
volume tidak lebih dari 200 μl, dan kapsul gelatin
dipakai untuk cairan dalam volume besar [Catatan
Kapsul gelatin mungkin mengandung campuran halida
atau belerang dalam jumlah cukup besar. Jika kapsul
seperti itu dipakai , lakukan penetapan blangko.]
Masukkan zat uji bersama kertas saring pita sumbu ke
dalam pembawa zat uji kasa platina. Masukkan cairan
penyerap yang disebutkan dalam masing-masing
monografi atau lampiran ke dalam labu, basahkan dengan
air bagian sumbat yang berhubungan dengan labu, alirkan
oksigen P dengan aliran yang cepat untuk mengusir udara
dari labu, goyangkan labu untuk membantu cairan
menyerap oksigen [Catatan Penjenuhan cairan dengan
oksigen sangat perlu untuk kesempurnaan pembakaran.]
Nyalakan pita sumbu dengan alat yang sesuai. Jika pita
dinyalakan di luar labu, segera masukkan pembawa zat
uji ke dalam labu, balikkan labu sampai cairan penyerap
membentuk sekat di sekeliling sumbat dan pegang kuat-
kuat sumbat di tempat. Jika pita dinyalakan dalam sistem
tertutup, labu tidak perlu di balik. sesudah pembakaran
sempurna kocok labu kuat-kuat, biarkan selama tidak
kurang dari 10 menit dengan sekali-sekali dikocok.
Lanjutkan penetapan menurut cara yang tertera pada
masing-masing monografi atau lampiran.
PENETAPAN KADAR VITAMIN A <511>
METODE KIMIA
Cara ini dipakai untuk penetapan vitamin A dalam
sediaan Farmakope. Lakukan penetapan secepat
mungkin, upayakan seminimum mungkin dari pengaruh
cahaya, oksigen dari udara dan zat pengoksidasi lain,
sebaiknya memakai alat kaca aktinik rendah dan gas
inert.
- 1462 -
Pereaksi Khusus
Eter pakailah eter P dalam waktu 24 jam sesudah
wadah dibuka.
Isopropanol pakailah isopropanol P kualitas
spektrofotometrik.
Alat
Hidrogenator Peralatan yang sesuai untuk hidrogenasi
tekanan rendah dapat dirangkai dengan cara sebagai
berikut: susun dalam rak atau klem tabung sentrifus
50 ml, yang dihubungkan secara seri dengan pipa kaca
dan plastik inert, dan penutup kaca, polimer atau gabus
yang sesuai (hindarkan seluruh pemakaian bahan karet).
pakailah satu tabung untuk blangko dan tabung lainnya
untuk zat uji. Rangkai pipa pendispersi gas sampai
hidrogen dikeluarkan sebagai gelembung pada dasar
masing-masing tabung. Alirkan hidrogen pertama melalui
tabung blangko dan lalu melalui tabung zat uji.
procedure Timbang, hitung, atau ukur secara saksama
sediaan uji setara dengan tidak kurang dari 0,15 mg
retinol namun tidak boleh mengandung lemak lebih dari
1 g. Bila berbentuk kapsul, tablet atau bentuk padat
lainnya yang tidak dapat disabunkan secara efisien
dengan cara yang diberikan, refluks dalam 10 ml air di
atas tangas uap selama lebih kurang 10 menit, hancurkan
bagian padat yang masih tertinggal dengan batang
pengaduk kaca tumpul, hangatkan selama lebih kurang
5 menit lagi.
Masukkan ke dalam labu kaca borosilikat yang sesuai,
tambahkan 30 ml etanol P, dan 3 ml larutan kalium
hidroksida P (9 dalam 10). Refluks dalam alat yang
keseluruhannya terbuat dari kaca borosilikat selama
30 menit. Dinginkan larutan, tambahkan 30 ml air,
masukkan ke dalam corong pisah. Tambahkan 4 g serbuk
halus natrium sulfat dekahidrat P. Ekstraksi satu kali
dengan 150 ml eter P, kocok selama 2 menit, bila
terbentuk emulsi, ekstraksi lagi 3 kali, tiap kali dengan
25 ml eter P. Kumpulkan ekstrak eter, bila perlu cuci
dengan 50 ml air dengan menggoyang perlahan-lahan.
Ulangi pencucian tiga kali, tiap kali dengan 50 ml air
dengan menggoyang lebih kuat. Pindahkan ekstrak eter
yang telah dicuci ke dalam labu tentukur 250-ml,
tambahkan eter P sampai tanda.
Uapkan 25,0 ml ekstrak eter sampai lebih kurang
5 ml. Tanpa pemanasan dan dengan bantuan aliran gas
inert atau hampa udara, lanjutkan penguapan sampai lebih
kurang 3 ml. Larutkan residu dalam isopropanol P
secukupnya sampai kadar vitamin A setara 3 μg sampai
5 μg per ml atau memberi serapan dalam rentang 0,5
sampai 0,8 pada panjang gelombang 325 nm. Ukur
serapan larutan pada panjang gelombang 310 nm, 325 nm
dan 334 nm memakai sel kuarsa dan pakailah
isopropanol P sebagai blangko.
JIKA MENGANDUNG TOKOFEROL Ukur saksama
beberapa zat uji atau timbang saksama tidak kurang dari
5 tablet atau kapsul yang telah digerus, masukkan ke
dalam labu kaca borosilikat. Refluks dalam alat yang
keseluruhannya terbuat dari kaca borosilikat dengan
30 ml etanol P dan 3 ml larutan kalium hidroksida P (9
dalam 10) selama 30 menit. Tambahkan 2,0 g asam sitrat
monohidrat P melalui kondenser, bilas dinding pendingin
dengan 10 ml air. Dinginkan, pindahkan larutan ke dalam
corong pisah dengan bantuan 20 ml air. Tambahkan 4 g
serbuk halus natrium sulfat dekahidrat P. Ekstraksi satu
kali dengan 150 ml eter P, dan jika terbentuk emulsi,
ekstraksi tiga kali, tiap kali dengan 25 ml eter P.
Kumpulkan ekstrak eter, bila perlu cuci dengan 50 ml air
dengan menggoyang perlahan-lahan. Ulangi pencucian
tiga kali, tiap kali dengan 50 ml air dengan menggoyang
lebih kuat. Pindahkan ekstrak eter yang telah dicuci ke
dalam labu tentukur 250-ml, tambahkan eter P sampai
tanda. Pipet 100 ml ekstrak eter, masukkan ke dalam
corong pisah, cuci satu kali dengan 50 ml larutan kalium
hidroksida P (1 dalam 33), bila perlu tambahkan etanol P
untuk memecahkan emulsi yang terbentuk. Cuci dengan
50 ml air dengan menggoyangkan perlahan-lahan. Ulangi
pencucian tiga kali, tiap kali dengan 50 ml air dengan
menggoyang lebih kuat. Pindahkan ekstrak eter yang
telah dicuci ke dalam labu tentukur 100-ml, tambahkan
eter P sampai tanda.
Uapkan 50,0 ml ekstrak eter yang tidak tersabunkan
sampai lebih kurang 5 ml. Hilangkan sisa eter tanpa
pemanasan dan dengan bantuan aliran gas inert atau
hampa udara, pindahkan residu eter. Larutkan residu
dalam 50,0 ml isopropanol P.
Bagian yang terhidrogenasi Pipet 15 ml larutan
isopropanol P ke dalam tabung sentrifuga 50-ml,
tambahkan lebih kurang 200 mg katalis paladium P, aduk
dengan batang pengaduk kaca dan hidrogenasi selama
10 menit dalam Hidrogenator. pakailah isopropanol P
sebagai blangko. Tambahkan lebih kurang 300 mg tanah
silika untuk kromatografi P, aduk dengan batang
pengaduk kaca, sentrifus segera sampai larutan jernih.
Pipet 1 ml larutan, uapkan pelarutnya, larutkan residu
dalam 1 ml kloroform P, tambahkan 10 ml asam
fosfomolibdat P LV, tidak terbentuk warna hijau biru.
[Catatan Bila terjadi warna hijau biru, ulangi
hidrogenasi dengan waktu lebih lama, atau pakailah
katalisator yang baru.]
Ke dalam dua labu terpisah, pipet masing-masing
beberapa volume sama Bagian yang terhidrogenasi dan
larutanisopropanol tanpa perlakuan, tambahkan
isopropanol P secukupnya sampai kadar vitamin A setara
3 - 5 μg per ml. Ukur serapan dalam rentang 0,5 - 0,8
pada 325 nm. Ukur serapan larutan isopropanol tanpa
perlakuan terhadap larutan Bagian yang terhidrogenasi
sebagai blangko pada panjang gelombang 310 nm,
325 nm dan 334 nm memakai kuvet atau sel kuarsa.
Perhitungan Hitung kadar Vitamin A dengan rumus:
A325 yaitu serapan pada panjang gelombang 325 nm; L
yaitu panjang sel, dalam cm; C yaitu jumlah sediaan
uji dalam g, kapsul atau tablet dalam tiap 100 ml larutan
akhir isopropanol, pada A325 memiliki harga tidak
kurang dari [A325]/1,030 dan tidak lebih dari [A325]/0,970,
dimana [A325] yaitu serapan pada 325 nm yang telah
dikoreksi dengan rumus:
- 1463 -
[A325] = 6,815 A325 – 2,555A310 – 4,260 A334
A yaitu serapan pada masing-masing panjang
gelombang.
Jika [A325] memiliki harga kurang dari A325/1,030,
pakailah rumus berikut:
Tiap mg Vitamin A (alkohol) setara dengan 3333 unit
Vitamin A FI.
Rentang kepercayaan Rentang batas kesalahan yang
menampilkan tingkat ketidak sesuaian yang diharapkan
pada hasil dari laboratorium yang berbeda pada P = 0,05,
yaitu kira-kira ± 8%.
METODE KROMATOGRAFI
procedure kromatografi cair kinerja tinggi berikut
dipakai untuk penetapan vitamin A. Jika pada procedure
disebutkan memakai ester vitamin A (retinil asetat
atau retinil palmitat), pakailah sesuai bentuk kimia yang
ada dalam bahan baku. pakailah alat gelas aktinik rendah.
Baku pembanding Vitamin A BPFI; Pada saat
dipakai , gunting ujung kapsul, keluarkan dan timbang
larutan. Buang bagian yang tidak dipakai sesudah
kapsul dibuka. Simpan dalam wadah tertutup rapat,
simpan pada tempat dingin dan kering atau pada lemari
pendingin, lindungi dari cahaya. [Catatan pakailah
Vitamin A BPFI, semua bentuk trans retinil asetat, untuk
penetapan bentuk sediaan farmasi yang pada etiket
mencantumkan mengandung retinol atau ester Vitamin A
(retinil asetat atau retinil palmitat).]
tahap gerak pakailah n-heksan P.
Larutan kesesuaian sistem Timbang saksama
beberapa retinil palmitat dan Vitamin A BPFI, larutkan
dalam n-heksana P sampai kadar masing-masing lebih
kurang 7,5 μg per ml.
Larutan baku Timbang saksama beberapa Vitamin A
BPFI, larutkan dalam n-heksana P, jika perlu encerkan
secara bertahap dan kuantitatif sampai kadar retinil asetat
lebih kurang 15 μg per ml.
Larutan uji Timbang saksama zat setara lebih kurang
15 mg ester vitamin A (retinil asetat atau retinil
palmitat), masukkan ke dalam labu tentukur 100-ml,
larutkan dan encerkan dengan n-heksana P sampai tanda.
Pipet 5 ml larutan ini ke dalam labu tentukur 50-ml
encerkan dengan n-heksana P sampai tanda.
Sistem kromatografi Lakukan seperti tertera pada
Kromatografi <931>. Kromatograf cair kinerja tinggi
dilengkapi dengan detektor 325 nm dan kolom 15 cm x
4,6 mm, berisi bahan pengisi L8. Laju alir lebih kurang
1 ml per menit. Lakukan kromatografi terhadap Larutan
kesesuaian sistem, rekam kromatogram dan ukur respons
puncak seperti tertera pada procedure : resolusi, R, antara
retinil asetat dan retinil palmitat tidak kurang dari 10;
simpangan baku relatif pada penyuntikan ulang tidak
lebih dari 3,0%.
procedure Suntikkan secara terpisah beberapa volume
sama (lebih kurang 40 μl) Larutan baku dan Larutan uji
ke dalam kromatograf, rekam kromatogram, ukur respons
puncak retinil asetat dari Larutan baku dan respons
puncak retinil asetat atau retinil palmitat dari Larutan uji.
Hitung jumlah dalam mg, vitamin A setara dengan
retinol, C20H30O, dalam bagian vitamin A yang dipakai
dengan rumus:
0,872 yaitu faktor konversi retinil asetat dari vitamin A
terhadap kesetaraan retinol; C yaitu kadar Vitamin A
BPFI, dalam mg per ml Larutan baku; D yaitu faktor
pengenceran Larutan uji, dalam ml; rU dan rS berturut-
turut yaitu respons puncak ester retinil dari Larutan
baku dan Larutan uji. [Catatan Respons molar retinil
asetat dan retinil palmitat yaitu setara.]
PENETAPAN KADAR ANTIBIOTIK SECARA
IODOMETRI <521>
Metode ini dipakai untuk penetapan kadar sebagian
besar senyawa antibiotik penisilin dan bentuk sediaannya
yang tercantum dalam Farmakope, dan titrasi iodometri
merupakan metode yang paling sesuai.
Larutan baku Timbang saksama beberapa Baku
Pembanding FI seperti tertera pada masing-masing
monografi, yang telah dikeringkan dengan cara seperti
yang tertera dalam monografi, larutkan dalam pelarut
seperti tertera pada Tabel Pelarut dan Kadar Akhir,
encerkan secara kuantitatif dan bertahap dengan pelarut
yang sama sampai kadar tertentu lebih kurang seperti
yang tertera dalam Tabel. Pipet masing-masing 2 ml
larutan ini ke dalam dua labu Erlenmeyer 125 ml
bersumbat kaca.
Tabel Pelarut dan Kadar Akhir
Antibiotik Pelarut* Kadar akhir
per ml
Amoksisilin Air 1,0 mg
Ampisilin Air 1,25 mg
Ampisilin Natrium Dapar nomor 1 1,25 mg
Kloksasilin Natrium Air 1,25 mg
Siklasilin Air 1,0 mg
Dikloksasilin Natrium Dapar nomor 1 1,25 mg
Metisilin Natrium Dapar nomor 1 1,25 mg
Nafsilin Natrium Dapar nomor 1 1,25 mg
Oksasilin Natrium Dapar nomor 1 1,25 mg
Penisilin G Kalium Dapar nomor 1 2000 unit
Penisilin G Natrium Dapar nomor 1 2000 unit
Penisilin V Kalium Dapar nomor 1 2000 unit
Fenetisilin Kalium Dapar nomor 1 2000 unit
* Kecuali dinyatakan lain, Dapar yaitu Dapar fosfat
seperti tertera pada Media dan Pengencer dalam
Penetapan Potensi Antibiotik secara Mikrobiologi
- 1464 -
<131>, kecuali tidak perlu dilakukan sterilisasi sebelum
dipakai .
Larutan uji Kecuali dinyatakan dalam masing-masing
monografi, timbang saksama beberapa tertentu zat uji,
larutkan dalam pelarut seperti tertera pada Tabel Pelarut
dan Kadar Akhir, dan encerkan secara kuantitatif dengan
pelarut yang sama sampai kadar tertentu lebih kurang
seperti tertera pada Tabel. Pipet masing-masing 2 ml
larutan ini ke dalam dua labu Erlenmeyer 125 ml
bersumbat kaca.
procedure Inaktivasi dan titrasi Pada 2,0 ml Larutan
baku dan Larutan uji dalam labu terpisah, masing-masing
tambahkan 2,0 ml natrium hidroksida 1,0 N, campur
dengan menggoyang labu, dan biarkan selama 15 menit.
Ke dalam tiap labu tambahkan 2,0 ml asam klorida 1,2 N
dan 10,0 ml iodum 0,01 N LV, segera tutup labu, biarkan
selama 15 menit. Titrasi dengan natrium tiosulfat 0,01 N
LV. Pada saat mendekati titik akhir, tambahkan 1 tetes
pasta kanji-iodida LP, lanjutkan titrasi sampai warna biru
hilang.
Penetapan blangko Ke dalam labu berisi 2,0 ml
Larutan baku tambahkan 10,0 ml iodum 0,01 N LV. Bila
Larutan baku mengandung amoksisilin atau ampisilin,
segera tambahkan 0,1 ml asam klorida 1,2 N. Segera
titrasi dengan natrium tiosulfat 0,01 N LV. Pada saat
mendekati titik akhir, tambahkan 1 tetes pasta kanji-
iodida LP, dan lanjutkan titrasi sampai warna biru hilang.
Lakukan dengan cara yang sama untuk labu berisi 2,0 ml
Larutan uji.
Perhitungan Hitung kesetaraan (F) dalam mikrogram
(atau unit) tiap ml natrium tiosulfat 0,01 N yang
dipakai oleh Larutan baku, dengan rumus :
)(
)2(
IB
CP
C yaitu kadar Baku Pembanding dalam mg per ml
Larutan baku; P yaitu potensi, dalam μg (atau unit) per
mg Baku Pembanding; B yaitu volume dalam ml,
natrium tiosulfat 0,01 N yang dipakai dalam Penetapan
blangko; I yaitu volume dalam ml, natrium tiosulfat
0,01 N yang dipakai dalam Inaktivasi dan titrasi.
Hitung potensi zat uji dengan rumus seperti tertera dalam
masing-masing monografi.
PENETAPAN KADAR BARBITURAT <531>
Baku internal, Larutan baku internal, Larutan baku
dan Larutan uji. Buat seperti tertera pada masing-masing
monografi.
Sistem kromatografi Lakukan seperti tertera pada
Kromatografi <931>. Kromatograf gas dilengkapi dengan
detektor ionisasi nyala dan kolom kaca 0,9 m x 4 mm
berisi 3 % bahan pengisi tahap cair G10 pada penyangga
S1A dengan ukuran partikel 80 mesh sampai 100 mesh.
Pertahankan suhu kolom pada suhu 200º±10º, injektor
dan detektor masing-masing pada suhu lebih kurang 225º.
Jika perlu suhu kolom dapat bervariasi dalam batas
ini , sampai memenuhi spesifikasi Kesesuaian sistem
dan diperoleh waktu retensi yang sesuai. pakailah gas
pembawa yang sesuai, seperti nitrogen kering, dengan
laju aliran yang sesuai, 60 - 80 ml per menit. Lakukan
penyuntikan langsung pada kolom.
[Catatan Jika pada alat tidak ada sarana untuk
penyuntikan langsung pada kolom, pakailah tempat
penyuntikan yang dilapisi kaca yang telah dicuci
berturut-turut dengan larutan penguji asam kromat, air,
metanol, kloroform, larutan trimetilklorosilan dalam
kloroform (1 dalam 10), dan kloroform.]
Kesesuaian sistem Lakukan seperti tertera pada
Kromatografi <931>. Suntikkan Larutan baku lima kali
ke dalam kromatograf, rekam kromatogram dan ukur
respons puncak seperti tertera pada procedure . Simpangan
baku relatif untuk RS tidak lebih dari 1,5%. Resolusi, R,
antara asam barbiturat dan Baku internal tidak kurang
dari harga yang diberikan dalam masing-masing
monografi, dan faktor ikutan, T, untuk kedua puncak
ini masing-masing tidak lebih dari 2,0.
procedure Suntikkan secara terpisah beberapa volume
sama (lebih kurang 5 μl) Larutan baku dan Larutan uji ke
dalam kromatograf, rekam kromatogram dan ukur
respons puncak utama. Hitung jumlah senyawa barbiturat
atau asam barbiturat dari Larutan uji dengan rumus
seperti yang tertera dalam masing-masing monografi. RU
yaitu perbandingan respons puncak asam barbiturat
terhadap Baku internal dari Larutan uji; QS yaitu
perbandingan bobot asam barbiturat dan Baku internal
dalam Larutan baku; C yaitu kadar dalam mg per ml
Baku internal dalam Larutan baku internal; RS yaitu
perbandingan respons puncak asam barbiturat terhadap
Baku internal dalam Larutan baku.
PENETAPAN KADAR GARAM BASA
NITROGEN ORGANIK <541>
Larutan baku Kecuali dinyatakan lain, timbang
saksama beberapa Baku Pembanding Farmakope
negara kita (BPFI), larutkan dalam larutan asam sulfat P
(1 dalam 70) sampai kadar lebih kurang 500 μg per ml,
dihitung terhadap zat anhidrat.
Larutan uji Jika bentuk tablet, timbang dan serbukkan
tidak kurang dari 20 tablet, timbang saksama beberapa
serbuk tablet setara dengan 25 mg zat aktif, dan
pindahkan ke dalam corong pisah 125 ml; atau jika
bentuk cair, ukur saksama beberapa volume setara dengan
lebih kurang 25 mg zat aktif, masukkan ke dalam corong
pisah 125 ml. Ke dalam corong pisah tambahkan 20 ml
larutan asam sulfat P (1 dalam 350 ml), dan kocok kuat
selama 5 menit. Tambahkan 20 ml eter P, kocok hati-hati,
saring lapisan asam ke dalam corong pisah 125 ml kedua.
Kocok lapisan eter dua kali, tiap kali dengan 10 ml
- 1465 -
larutan asam sulfat P (1 dalam 350), saring tiap lapisan
asam ke dalam corong pisah 125 ml kedua dan buang
lapisan eter. Pada ekstrak asam tambahkan 10 ml natrium
hidroksida LP dan 50 ml eter P, kocok hati-hati,
pindahkan lapisan air ke dalam corong pisah 125 ml
ketiga berisi 50 ml eter P. Kocok corong pisah ketiga
hati-hati, buang lapisan air, cuci larutan eter, pada corong
pisah kedua dan ketiga berturut-turut dengan 20 ml air,
buang lapisan air. Ekstraksi kedua larutan eter masing-
masing dengan 20 ml, 20 ml, dan 5 ml larutan asam sulfat P
(1 dalam 70). Lakukan ekstraksi pada corong pisah ketiga
lebih dahulu, sesudah itu corong pisah kedua. Campur
ekstrak asam dalam labu tentukur 50-ml, encerkan
dengan asam sampai tanda.
[Catatan Heksana atau heptana dapat dipakai sebagai
pengganti eter jika perbandingan distribusi basa nitrogen
antara air dengan heksana, atau air dengan heptana,
memberi ekstraksi sempurna dengan tahap gerak.]
procedure Kecuali dinyatakan lain, encerkan masing-
masing 5,0 ml Larutan baku dan Larutan uji dengan
larutan asam sulfat P (1 dalam 70) sampai 100,0 ml dan
tetapkan serapan tiap larutan pada panjang gelombang
tertentu memakai larutan asam sulfat P (1 dalam 70)
sebagai blangko. Hitung hasil penetapan kadar seperti
tertera pada tiap monografi; AS dan AU berturut-turut
yaitu serapan Larutan baku dan Larutan uji.
PENETAPAN KADAR GULA DARAH <551>
Kadar gula darah dapat ditetapkan dengan salah satu
cara di bawah ini.
A. Cara Tembaga (II) Iodida
Pereaksi
Larutan zink sulfat asam Larutkan 12,5 g zink sulfat P
dalam lebih kurang 200 ml air, tambahkan 31,25 ml asam
sulfat 1 N dan air secukupnya sampai 1000,0 ml. ukur
seksama 50 ml larutan, tambahkan 3 tetes fenolftalein LP.
Titrasi perlahan-lahan sambil terus menerus diaduk
dengan campuran yang terdiri dari 81 ml natrium
hidroksida 1 N dan air secukupnya sampai 100,0 ml:
terjadi warna merah jambu stabil. Diperlukan tidak
kurang dari 6,2 ml dan tidak lebih dari 6,3 ml.
procedure Masukkan 1 ml darah dan 8 ml Larutan
zink sulfat asam ke dalam labu atau tabung reaksi.
Tambahkan 1 ml campuran yang terdiri dari 81 ml
natrium hidroksida 1 N dan air secukupnya sampai
100,0 ml, tutup, kocok kuat-kuat, biarkan selama
beberapa menit, saring melalui penyaring kering ke dalam
labu. Pada 5 ml tembaga(II) iodida alkali LP dalam
tabung reaksi diameter 25 mm, panjang 200 mm,
tambahkan 2 ml sampai 5 ml filtrat yang telah diukur
saksama, campur perlahan-lahan, tutup labu tidak terlalu
rapat. Tempatkan pada rak logam yang dibuat sedemikian
rupa sampai tabung tidak bergoyang selama pemanasan
dalam tangas air. Masukkan dalam tangas air sedalam
lebih kurang 10 cm, panaskan selama 20 menit.
Dinginkan cepat dengan air sampai suhu dibawah 30°
sambil mencegah goncangan. Asamkan dengan 5 ml
asam sulfat 1 N, campur perlahan-lahan, biarkan selama
tidak kurang dari 1 menit. Titrasi dengan natrium
tiosulfat 0,005N LV segar memakai indikator 1 ml
kanji LP. Lakukan penetapan blangko dengan mengganti
filtrat darah dengan air. Hitung jumlah glukosa dalam g
per 1000 ml darah dengan rumus :
F
V 13,1×
V yaitu jumlah dalam ml natrium tiosulfat 0,005 N LV
yang diperlukan; F yaitu jumlah dalam ml filtrat darah
yang dipakai .
B. Cara Mikro Kalium Heksasianoferat (III)
Pereaksi
Campuran oksalat-fluorida Campur hati-hati 6 g
kalium oksalat P dengan 4 g natrium fluorida P bebas
nitrat.
Larutkan kadmium sulfat asam Larutkan 26 g
kadmium sulfat P dalam 127 ml asam sulfat 1 N dan air
secukupnya sampai l 1000,0 ml.
Larutan natrium hidroksida Pada 55 ml natrium
hidroksida 1 N tambahkan air secukupnya sampai
100,0 ml.
Kalium heksasianoferat (III) 0,005 M basa Larutkan
1,645 g kalium heksasianoferat (III) P dan 28,60 g
natrium karbonat P dalam air secukupnya sampai
1000,0 ml. simpan dalam wadah tertutup rapat, terlindung
cahaya.
Larutan zink Larutkan 50 mg zink sulfat P dan 250 g
natrium klorida P dalam air secukupnya sampai
1000,0 ml.
Larutan kalium iodida Larutkan 15 g kalium iodida P
dalam air untuk injeksi P secukupnya sampai 100,0 ml.
Simpan dalam botol bersumbat kaca terlindung cahaya.
Larutan asam asetat Larutkan 3 g asam asetat glasial
P dalam air secukupnya sampai 100,0 ml.
Pengujian terhadap pereaksi Pada 3 ml campuran
segar Larutan zink dan Larutan kalium iodida (6:1),
tambahkan 2 ml Larutan asama asetat dan 3 sampai
6 tetes kanji LP, tidak terjadi warna biru dalam 1 menit.
Tambahkan 0,02 ml kalium heksasianoferat (III) 0,005 M
basa: terjadi warna biru lemah yang nyata.
Larutan uji Masukkan 10,4 ml air ke dalam tabung
sentrifuga, tambahkan dengan pipet mikro skala 0,1 ml,
darah yang sebelumnya disiapkan dengan menambahkan
80 mg Campuran oksalat-fluorida per 10 ml darah. Bilas
pipet hati-hati dengan cairan yang ada dalam tabung
sentrifuga dengan pengisapan dan pengeluaran cepat.
Tambahkan 1 ml Larutan kadmium sulfat asam, campur,
tambahkan tetes demi tetes 0,5 ml Larutan natrium
hidroksida sambil dikocok, biarkan selama beberapa
menit, sentrifus dengan kecepatan tinggi. Enap tuangkan
sesempurna mungkin ke dalam labu Erlenmeyer.
- 1466 -
Larutan pembanding Pada waktu bersamaan buat
campuran yang terdiri dari 10,5 ml air, 1 ml Larutan
kadmium sulfat asam dan 0,5 ml Larutan natrium
hidroksida.
procedure Pipet 10 ml Larutan uji ke dalam labu
Erlenmeyer 30 ml dan 10 ml Larutan pembanding ke
dalam labu Erlenmeyer 30 ml yang lain. Pada masing-
masing labu tambahkan 2 ml kalium heksasianoferat (III)
0,005 M basa. Panaskan kedua labu di atas tangas air
selama 20 menit, dinginkan dengan air dingin tanpa
dikocok. Pada masing-masing labu tambahkan 3 ml
campuran Larutan zink dan Larutan kalium iodida (6:1),
kocok, lalu tambahkan 2 ml Larutan asam asetat,
biarkan selama 5 menit. Titrasi dengan natrium tiosulfat
0,005 N LV dengan indikator kanji LP memakai
buret mikro skala 0,01 ml. Hitung kadar gula darah dalam
g glukosa per 1000 ml darah, dalam Tabel hubungan
antara kadar gula darah dengan nilai N. Nilai N dihitung
dengan rumus:
yaitu volume dalam ml natrium tiosulfat 0,005 N yang
dipakai beningan yang mengandung darah;
yaitu volume dalam ml natrium tiosulfat 0,005 N
yang dipakai dalam larutan pembanding.
Tabel hubungan antara kadar gula darah
dengan nilai N
Satuan Persepuluhan Perseratusan
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 0 0,02 0,03 0,05 0,07 0,08 0,10 0,12 0,14 0,15
0 1 0,17 0,19 0,20 0,22 0,24 0,25 0,27 0,29 0,31 0,32
0 2 0,34 0,36 0,38 0,39 0,41 0,43 0,45 0,47 0,48 0,50
0 3 0,52 0,54 0,56 0,57 0,59 0,61 0,63 0,65 0,66 0,68
0 4 0,70 0,72 0,74 0,75 0,77 0,79 0,81 0,83 0,84 0,86
0 5 0,88 0,90 0,92 0,93 0,95 0,97 0,99 1,01 1,02 1,04
0 6 1,06 1,08 0,10 1,11 1,13 1,15 1,17 1,19 1,20 1,22
0 7 1,24 1,25 1,27 1,29 1,31 1,32 1,34 1,36 1,38 1,39
0 8 1,41 1,43 1,45 1,46 1,45 1,50 1,52 1,54 1,55 1,57
0 9 1,59 1,61 1,67 1,64 1,66 1,68 1,70 1,72 1,73 1,75
PENETAPAN KADAR KALSIFEROL <561>
METODE KROMATOGRAFI
procedure kromatografi cair kinerja tinggi berikut
yaitu dipakai untuk penetapan Vitamin D sebagai
kolekalsiferol atau sebagai ergokalsiferol, yang
merupakan salah satu kandungan sediaan multi vitamin.
Selama penetapan, lindungi larutan yang mengandung
atau yang diperoleh dari bahan uji, dan Baku Pembanding
terhadap udara dan cahaya. Sebaiknya memakai
lapisan gas inert dan alat gelas rendah aktinik.
Baku pembanding [Catatan pakailah Ergokalsiferol
BPFI atau Kolekalsiferol BPFI untuk penetapan kadar
sediaan farmasi yang pada etiket mengandung vitamin D
sebagai ergokalsiferol atau kolekalsiferol.] Kolekalsiferol
BPFI; 4,6-Kolestadienol BPFI; Ergokalsiferol BPFI;
Vitamin D BPFI untuk Kesesuaian Sistem pada
Penetapan Kadar. Simpan ditempat yang dingin,
terlindung cahaya. Biarkan mencapai suhu kamar
sebelum ampul
dibuka. pakailah zat segera, dan buang sisa yang tidak
terpakai.
Pereaksi dan larutan khusus
Eter pakailah etil eter P. pakailah dalam waktu
24 jam sesudah wadah dibuka.
Heksan dehidrat Siapkan kolom kromatografi dengan
mengisi tabung kromatografi berukuran 60 x 8 cm
dengan 500 g tanah silika untuk kromatografi, ukuran
50 μm sampai 250 μm, yang diaktifkan dengan
pengeringan pada suhu 150º selama 4 jam seperti tertera
pada Kromatografi adsorpsi kolom dalam Kromatografi
<931>. Tuangkan 500 ml heksan P melalui kolom, dan
kumpulkan eluat dalam labu bertutup kaca.
Larutan hidroksitoluen terbutilasi Larutkan beberapa
hidroksitoluen terbutilasi dalam heksan untuk
kromatografi sampai kadar 10 mg per ml.
Larutan kalium hidroksida dalam air Larutkan 500 mg
kalium hidroksida P dalam 500 ml air yang baru
dididihkan, campur dan dinginkan. Buat larutan ini segar
setiap hari.
- 1467 -
Larutan kalium hidroksida etanol Larutkan 3 g kalium
hidroksida P dalam 50 ml air yang baru dididihkan,
tambahkan 10 ml etanol P, encerkan dengan air yang
baru dididihkan sampai 100 ml, campur. Buat larutan ini
segar setiap hari.
Larutan natrium askorbat Larutkan 3,5 g asam
askorbat P dalam 20 ml natrium hidroksida 1 N. Buat
larutan ini segar setiap hari.
Larutan natrium sulfida Larutkan 12 g natrium sulfida
P dalam 20 ml air, encerkan dengan gliserin P sampai
100 ml.
tahap gerak A Buat campuran asetonitril P- metanol
P–air (25:25:1). Jumlah air dan laju aliran dapat diubah-
ubah agar memenuhi persyaratan Kesesuaian sistem.
tahap gerak B Buat campuran n-amil alkohol P dalam
heksan dehidrat P (3 dalam 1000). Perbandingan
komponen dan laju aliran dapat diubah-ubah agar
memenuhi persyaratan Kesesuaian sistem.
Larutan baku internal Timbang saksama 15 mg
4,6-Kolestadienol BPFI, masukkan ke dalam labu
tentukur 200-ml, tambahkan campuran toluen P dan tahap
gerak B (1 dalam 10) sampai tanda.
Larutan baku Timbang saksama lebih kurang 25 mg
Ergokalsiferol BPFI atau Kolekalsiferol BPFI, masukkan
ke dalam labu tentukur 50-ml, larutkan dalam toluen P
tanpa pemanasan, tambahkan toluen P sampai tanda.
Pipet 10 ml larutan persediaan ini ke dalam labu tentukur
100-ml, encerkan dengan toluen P sampai tanda. Buat
larutan persediaan segar setiap hari.
Penetapan Kadar
Untuk larutan mengandung minyak Timbang saksama
beberapa zat, sebaiknya lebih dari 500 mg dan setara
dengan lebih kurang 125 μg kolekalsiferol atau
ergokalsiferol (5000 unit FI). Tambahkan 1 ml Larutan
natrium askorbat, 25 ml etanol P, dan 2 ml Larutan
kalium hidroksida dalam air, campur.
Untuk kapsul atau tablet Refluks tidak kurang dari 10
kapsul atau tablet dengan campuran 10 ml Larutan
natrium askorbat dan 2 tetes Larutan natrium sulfida di
atas tangas uap selama 10 menit, hancurkan setiap
padatan yang tertinggal dengan batang pengaduk kaca
tumpul, dan lanjutkan pemanasan selama 5 menit.
Dinginkan, tambahkan 25 ml etanol P dan 3 ml Larutan
kalium hidroksida dalam air, dan campur.
Untuk sediaan kering dan dispersi dalam air Timbang
saksama beberapa zat, sebaiknya lebih dari 500 mg dan
setara dengan lebih kurang 125 μg kolekalsiferol atau
ergokalsiferol (5000 unit FI). Tambahkan sedikit demi
sedikit, sambil digoyang perlahan, 25 ml etanol P, 5 ml
Larutan natrium askorbat dan 3 ml Larutan kalium
hidroksida dalam air, dan campur.
Penyabunan dan ekstraksi Refluks beberapa zat di atas
tangas uap selama 30 menit. Dinginkan segera di bawah
air mengalir, dan pindahkan campuran yang sudah
tersabunkan ke dalam corong pisah, bilas labu
penyabunan dua kali, tiap kali dengan 15 ml air, 10 ml
etanol P dan dua kali, tiap kali dengan 50 ml eter P.
Kocok kuat campuran yang sudah tersabunkan dan bilas
selama 30 detik, diamkan sampai kedua lapisan jernih.
Pindahkan lapisan air ke dalam corong pisah kedua,
tambahkan campuran 10 ml etanol P dan 50 ml heksan P,
kocok kuat. Biarkan memisah, pindahkan tahap air ke
dalam corong pisah ketiga, dan pindahkan tahap heksan ke
corong pisah pertama, bilas corong pisah kedua 2 kali,
tiap kali dengan 10 ml heksan P, tambahkan bilasan ke
corong pisah pertama. Kocok tahap air dalam corong pisah
ketiga dengan 50 ml heksan P dan tambahkan tahap heksan
ke corong pisah pertama. Cuci gabungan ekstrak eter-
heksan dengan mengocok kuat tiga kali, tiap kali dengan
Larutan kalium hidroksida etanol, cuci secara kuat
dengan 50 ml air sampai pencucian terakhir netral
terhadap fenolftalein P. Tiriskan sisa tetesan air dari
gabungan ekstrak eter-heksan, masukkan dua lembar
kertas saring 9 cm dalam bentuk pita-pita ke dalam
corong pisah dan kocok. Pindahkan ekstrak eter-heksan
yang sudah dicuci ke dalam labu alas bundar, bilas
corong pisah dan kertas dengan heksan P. Gabungkan
bilasan heksan dengan ekstrak eter-heksan, tambahkan
5,0 ml Larutan baku internal dan 100 μl Larutan
hidroksitoluen terbutilasi dan campur. Uapkan sampai
kering dalam hampa udara dengan menggoyang dalam
tangas air pada suhu tidak lebih dari 40º. Dinginkan di
bawah air mengalir dan tambahkan gas nitrogen
secukupnya untuk memulihkan kembali tekanan
atmosfer. Segera larutkan residu dalam 5,0 ml campuran
asetonitril P-metanol P dengan perbandingan volume
yang sama atau dalam beberapa tertentu campuran
asetonitril P-metanol P sampai kadar vitamin D lebih
kurang 25 μg per ml, untuk mendapatkan Larutan uji.
Sistem kromatografi pakailah kromatografi yang
dioperasikan pada suhu kamar dilengkapi dengan detektor
ultra violet pada 254 nm, kolom pembersih baja tahan
karat ukuran 30 cm x 4,6 mm, berisi bahan pengisi L7
dan memakai tahap gerak A dan kolom analitik baja
tahan karat ukuran 25 cm x 4,6 mm, berisi bahan pengisi
L3 dan memakai tahap gerak B.
Uji kesesuaian sistem kolom pembersih Pipet 5 ml
Larutan baku ke dalam labu alas bulat yang dilengkapi
dengan pendingin refluks, tambahkan 2 atau 3 butir
hablur hidroksitoluen terbutilasi. Alirkan gas nitrogen
dan panaskan di atas tangas air pada suhu 900 dalam
cahaya redup dan di bawah atmosfer nitrogen selama
45 menit, untuk mendapatkan larutan yang mengandung
vitamin D dan pre-vitamin D. Dinginkan, tambahkan
10,0 ml Larutan baku internal, campur, uapkan sampai
kering dalam hampa udara dengan menggoyang dalam
tangas air pada suhu tidak lebih 40º. Dinginkan di bawah
air mengalir, dan alirkan gas nitrogen secukupnya untuk
memulihkan kembali tekanan atmosfer. Segera larutkan
residu dalam 10,0 ml campuran asetonitril P dan metanol
P dengan perbandingan volume sama, campur. Suntikkan
500μl larutan ini ke dalam kolom pembersih, rekam
kromatogram dan ukur respons puncak seperti tertera
pada procedure . Kromatogram menampilkan adanya
puncak dengan waktu retensi antara 5 menit dan 9 menit,
sesuai dengan pemisahan satu puncak tunggal dari
campuran vitamin D, pre-vitamin D, dan 4,6-
- 1468 -
Kolestadienol dari senyawa lain. Bila perlu, atur
kandungan air atau parameter kerja lainnya seperti tertera
pada tahap gerak A.
Uji kesesuaian sistem kolom analitik Masukkan lebih
kurang 100 mg Vitamin D BPFI untuk Kesesuaian Sistem
pada Penetapan Kadar ke dalam labu tentukur 100-ml,
tambahkan campuran toluen P-tahap gerak B ( 1dalam 20)
sampai tanda, campur. Refluks beberapa larutan pada
suhu 90º selama 45 menit dan dinginkan. Lakukan lima
kali penyuntikan dari larutan ini, rekam kromatogram dan
ukur respons puncak seperti tertera pada procedure :
resolusi, R, antara trans-kolekalsiferol dan pre-
kolekalsiferol tidak kurang dari 1,0 dan simpangan baku
relatif untuk respons puncak kolekalsiferol tidak lebih
dari 2,0%. [Catatan Kromatogram yang diperoleh pada
uji ini menampilkan waktu retensi relatif lebih kurang 0,4
untuk pre-kolekalsiferol; 0,5 untuk trans-kolekalsiferol
dan 1,0 untuk kolekalsiferol.]
Kalibrasi
Faktor respons vitamin D Masukkan 4,0 ml Larutan
baku dan 10,0 ml Larutan baku internal dalam labu
tentukur 100-ml encerkan dengan tahap gerak B sampai
tanda, campur untuk mendapatkan Larutan baku kerja.
Simpan Larutan baku kerja pada suhu tidak lebih dari 0º,
simpan bagian yang tak dipakai untuk procedure .
Suntikkan 200μl Larutan baku kerja ke dalam kolom
analitik, ukur respons puncak untuk vitamin D dan 4,6-
Kolestadienol. Waktu retensi relatif untuk 4,6-
Kolestadienol lebih kurang 1,3. Hitung faktor respons,
FD, dengan rumus:
( )RS
S
CR
C
×
Cs dan CR berturut-turut yaitu kadar vitamin D dan
4,6-Kolestadienol, dalam μg per ml, dalam Larutan
baku kerja; dan Rs yaitu perbandingan respons puncak
vitamin D terhadap 4,6-Kolestadienol.
Faktor respons pre-vitamin D Pipet 4 ml Larutan baku
ke dalam labu alas bulat yang dilengkapi dengan
pendingin refluks, tambahkan 2 atau 3 butir hablur
hidroksitoluen terbutilasi. Alirkan gas nitrogen P dan
panaskan di atas tangas air pada suhu 900 dalam cahaya
redup dan di bawah atmosfer nitrogen selama 45 menit,
untuk mendapatkan larutan yang mengandung vitamin D
dan pre-vitamin D. Dinginkan, pindahkan dengan bantuan
tahap gerak B ke labu tentukur 100-ml yang berisi 10,0 ml
Larutan baku internal,encerkan dengan tahap gerak B
sampai tanda, campur, diperoleh Campuran kerja.
Suntikkan 200μl Campuran kerja ini ke dalam kolom
analitik, dan ukur respons puncak untuk vitamin D, pre-
vitamin D dan 4,6-Kolestadienol. Hitung kadar (Cs)
vitamin D, dalam μg per ml, dalam Campuran kerja
(dipanaskan) dengan rumus:
FD CRR’s
CR yaitu kadar 4,6-Kolestadienol, dalam μg per ml,
dan R’s yaitu perbandingan respons puncak vitamin D
terhadap 4,6-Kolestadienol. Hitung kadar (C’PRE) pre-
vitamin D, dalam μg per ml, dalam Campuran kerja
dengan rumus:
C’PRE = Cs – C’s
Hitung faktor respons pre-vitamin D, FPRE, dengan
rumus:
( FDR’s C’PRE)/(R’PRE C’s)
R’PRE yaitu perbandingan respons puncak pre-vitamin D
terhadap 4,6-Kolestadienol. [Catatan Nilai FPRE
ditetapkan dua kali pada hari yang berlainan, dapat
dipakai untuk seluruh procedure .]
procedure Suntikkan 500μl Larutan uji ke dalam
kolom pembersih, dan tampung dalam labu alas bulat
fraksi yang keluar pada 0,7 - 1,3 relatif terhadap waktu
retensi puncak campuran vitamin D seperti tertera pada
Uji kesesuaian sistem kolom pembersih . Tambahkan
50μl Larutan hidroksitoluen terbutilasi, campur dan
uapkan dalam hampa udara sampai kering dalam tangas
air pada suhu tidak lebih dari 40º sambil digoyang.
Dinginkan di bawah air mengalir dan alirkan gas nitrogen
secukupnya untuk memulihkan kembali tekanan
atmosfer. Segera larutkan residu dalam 5,0 ml campuran
toluen P- metanol P (1 dalam 20). Suntikkan 200μl
larutan ini ke dalam kolom analitik, rekam kromatogram
dan ukur respons vitamin D, pre- vitamin D, dan 4,6-
Kolestadienol. Hitung kadar kolekalsiferol (C27H44O)
atau ergokalsiferol (C28H44O), dalam μg per ml, dalam
Larutan uji dengan rumus:
(R”DFD + R”PRE FPRE)C”R
R”D yaitu perbandingan respons puncak vitamin D
terhadap 4,6-Kolestadienol; R”PRE yaitu perbandingan
respons puncak pre-vitamin D terhadap 4,6-
Kolestadienol; C”R yaitu kadar 4,6-Kolestadienol,
dalam μg per ml Larutan uji.
METODE KIMIA
procedure berikut ini dipakai untuk penetapan
vitamin D sebagai suatu kandungan dalam sediaan
Farmakope.
Lakukan penetapan dengan cepat, selama percobaan
dilakukan harus diusahakan agar paparan udara dan
cahaya aktinik serendah mungkin, sebaiknya
memakai lapisan gas inert dan peralatan gelas rendah
aktinik.
Baku pembanding [Catatan pakailah Ergokalsiferol
BPFI atau Kolekalsiferol BPFI untuk penetapan kadar
sediaan farmasi yang pada etiket mengandung vitamin D
sebagai ergokalsiferol atau kolekalsiferol.] Kolekalsiferol
BPFI; Ergokalsiferol BPFI.
- 1469 -
Pereaksi dan larutan khusus
Tanah Fuller untuk kromatografi pakailah tanah fuller
untuk kromatografi yang memiliki kandungan air
dengan susut pengeringan antara 8,5% dan 9,0%.
Heksan P pakailah heksan P seperti tertera pada
Pereaksi, Indikator dan Larutan, bila perlu didestilasi
kembali agar memenuhi persyaratan tambahan berikut
ini: Kemurnian spektral Ukur dalam kuvet 1 cm secara
spektrofotometri pada 300 nm terhadap udara sebagai
blangko; serapan tidak lebih dari 0,070.
Etilen diklorida Murnikan melalui kolom granul silika
gel (20 mesh sampai 200 mesh).
Larutan kalium hidroksida Larutkan 500 g kalium
hidroksida P dalam air sampai 1000 ml.
Larutan hidroksi toluen terbutilasi Larutkan 10 mg
hidroksitoluen terbutilasi P dalam 100 ml etanol P. Buat
larutan ini segar setiap hari.
Eter pakailah eter yang baru didestilasi, buang 10%
destilat awal dan destilat akhir.
Pereaksi warna Buat 2 larutan persediaan sebagai
berikut:
Larutan A Keluarkan tanpa menimbang, seluruh kristal
kering antimon triklorida P dari botol yang berisi 113 g
zat yang belum pernah dibuka sebelumnya. Masukkan ke
dalam labu yang berisi lebih kurang 400 ml Etilen
diklorida P. Tambahkan lebih kurang 2 g alumina
anhidrat P, campur, dan saring melalui kertas saring ke
dalam wadah kaca jernih bersumbat kaca dan terkalibrasi
pada 500 ml. Encerkan dengan etilen diklorida P sampai
tanda, campur: serapan larutan tidak lebih dari 0,070,
diukur dalam kuvet 20 mm pada 500 nm memakai
spektrofotometer terhadap blangko etilen diklorida P.
Larutan B Campur di dalam lemari asam, 100 ml asetil
klorida P dan 400 ml etilen diklorida P. Campur 45 ml
Larutan A dan 5 ml Larutan B untuk mendapatkan
Pereaksi warna. Simpan dalam wadah tertutup rapat, dan
pakailah dalam 7 hari, buang pereaksi jika terbentuk
warna.
Tabung Kromatografi
Kolom pertama Susun untuk mendapatkan peralatan
kromatografi kolom menurun, sebuah tabung berdiameter
dalam 2,5 cm, panjang lebih kurang 25 cm, dan
menyempit menjadi berdiameter 8 mm sepanjang 5 cm
pada ujung bawah, masukkan kaca masir berporositas
besar atau sumbat kecil wol kaca pada batas
penyempitan. Bagian yang menyempit dapat dilengkapi
dengan kran plastik inert.
Kolom kedua Pilih tabung yang terdiri dari tiga bagian:
1. Bagian atas yang melebar, dengan diameter dalam
18 mm dan panjang lebih kurang 14 cm; 2. Bagian tengah
dengan diameter dalam 6 mm dan panjang lebih kurang
25 cm, dan 3. Tabung bagian bawah yang menyempit dan
runcing untuk pengeluaran dengan panjang lebih kurang
5 cm. Masukkan sumbat kecil wol kaca 1 cm di sebelah
atas bagian yang menyempit.
Kolom kromatografi
Kolom pertama Pada lebih kurang 125 ml isooktan P
pada botol bermulut lebar dan bertutup ulir, tambahkan
25 g tanah silika untuk kromatografi, dan kocok sampai
terbentuk massa kental. Tambahkan 10 ml polietilen
glikol 600 P tetes demi tetes sambil diaduk kuat. Buka
tutup botol, kocok kuat selama 2 menit. Tuangkan lebih
kurang setengah bagian massa kental ke dalam tabung
kromatografi dan biarkan mengendap oleh gravitasi.
lalu pasang pompa pengisap dan tambahkan sisa
suspensi sedikit demi sedikit, dengan memampatkan
setiap kali memakai alat penekan. Jika terbentuk
permukaan yang padat, hentikan pompa pengisap dan
tambahkan 2 ml isooktan P.
Kolom kedua Isi bagian tengah tabung dengan 3 g
tanah fuller untuk kromatografi P yang agak kasar
dengan bantuan pompa penghisap berdaya lemah (lebih
kurang 125 mm raksa).
Larutan baku Timbang saksama lebih kurang 25 mg
Baku pembanding, larutkan dalam isooktan P sampai
kadar lebih kurang 250 μg per ml. Simpan dalam lemari
pendingin. Pada saat penetapan, pipet 1 ml larutan ini ke
dalam labu tentukur 50 ml, uapkan pelarut dengan aliran
nitrogen P, larutkan dan encerkan residu dengan etilen
diklorida P sampai tanda.
Larutan uji Timbang atau ukur saksama beberapa
contoh setara dengan tidak kurang dari 125 μg, namun
sebaiknya setara dengan lebih kurang 250 μg
ergokalsiferol (10.000 unit FI). Jika hanya ada sedikit
atau tidak ada vitamin A sama sekali dalam contoh,
tambahkan lebih kurang 1,5 mg vitamin A asetat (setara
dengan 3000 unit FI) untuk memberi pita pemandu
dalam kromatografi berikutnya.
Untuk kapsul atau tablet, refluks tidak kurang dari 10
buah dalam 10 ml air di atas tangas uap selama lebih
kurang 10 menit, hancurkan sisa padatan dengan batang
pengaduk kaca dan hangatkan lagi selama 5 menit.
Tambahkan beberapa volume Larutan kalium
hidroksida sebanyak 2,5 ml untuk setiap gram contoh,
namun tidak kurang dari total 3,0 ml. Tambahkan 10 ml
larutan hidroksi toluen terbutilasi dan 20 ml etanol P.
Refluks kuat di atas tangas uap selama 30 menit.
Dinginkan, pindahkan campuran yang sudah tersabunkan
ke dalam corong pisah, bilas labu penyabunan tiga kali
tiap kali dengan 10 ml air lalu bilas tiga kali tiap
kali dengan 50 ml eter P, tambahkan setiap bilasan ke
dalam corong pisah. Tambahkan lebih kurang 4 g natrium
sulfat dekahidrat P ke dalam corong pisah, dan ekstraksi
dengan mengocok selama 2 menit. Jika terbentuk emulsi,
ekstraksi tiga kali tiap kali dengan 25 ml eter P.
Gabungkan ekstrak eter, jika perlu cuci dengan 50 ml air
sambil digoyang lemah. Ulangi pencucian beberapa kali
dengan pengocokan lebih kuat, tiap kali memakai
50 ml air sampai pencucian terakhir tidak menampilkan
warna merah muda pada penambahan fenolftalein LP.
Pindahkan ekstrak eter yang sudah dicuci ke dalam labu
tentukur 250-ml, encerkan dengan eter P sampai tanda,
campur. Pindahkan seluruh atau beberapa volume yang
diukur saksama yang mengandung 250 μg ke dalam gelas
piala 400 ml berisi lebih kurang 5 g natrium sulfat
anhidrat P. Aduk selama 2 menit, enaptuangkan larutan
- 1470 -
ke dalam gelas piala kedua. Bilas natrium sulfat tiga kali
tiap kali dengan 25 ml eter P, tambahkan tiap bilasan ke
bagian utama. Uapkan di atas tangas uap sampai lebih
kurang 30 ml, pindahkan konsentrat ke dalam labu
penguapan alas bulat. Bilas gelas piala tiga kali tiap kali
dengan 10 ml eter P, tambahkan bilasan ke dalam
labu.Uapkan sisa pelarut dengan sempurna di atas tangas
air pada suhu tidak lebih dari 400 dengan bantuan hampa
udara, atau dengan aliran gas nitrogen pada suhu kamar.
Larutkan residu dalam sedikit heksan P, pindahkan ke
dalam labu tentukur 10-ml, encerkan dengan heksan P
sampai tanda, campur untuk mendapatkan Larutan uji.
procedure
Kromatografi kolom pertama Segera sesudah 2 ml
isooktan P habis dari permukaan Kolom pertama, pipet
2 ml Larutan uji ke dalam kolom. sesudah meniskus
Larutan uji mencapai permukaan kolom, tambahkan 2 ml
pertama dari tiga kali 2 ml heksan P, tambahkan tiap
bagian berturut-turut sebelum larutan habis masuk ke
dalam kolom. Lanjutkan penambahan heksan P 5 - 10 ml
sampai jumlah penambahan yaitu 100 ml. Jika perlu,
atur laju aliran antara 3 ml dan 6 ml per menit dengan
memberi tekanan lemah pada bagian atas tabung
kromatografi.
Buang 20 ml eluen pertama, tampung sisanya. Amati
kolom di bawah cahaya ultra violet pada beberapa
interval selama kromatografi berlangsung, dan hentikan
aliran jika batas pita yang berfluoresensi yang
menampilkan vitamin A berada lebih kurang 5 mm dari
dasar kolom. (Lampu ultra violet harus memberi
radiasi lemah pada daerah 300 nm. Seringkali diperlukan
pemakaian celah atau tabir sempit dengan lampu
perdagangan untuk mengurangi jumlah radiasi sampai
persyaratan minimum untuk mendeteksi vitamin A dalam
kolom).
Pindahkan eluat ke dalam labu penguapan yang sesuai,
uapkan heksan dengan sempurna di bawah hampa udara
pada suhu tidak lebih dari 40° atau dengan aliran gas
nitrogen pada suhu kamar. Larutkan residu dalam lebih
kurang 10 ml heksan P.
Kromatografi kolom kedua Tambahkan Larutan
Heksana pelarut yang diperoleh dari Kromatografi kolom
pertama pada Kolom kedua. Bilas labu penguapan dengan
total 10 ml heksan P sedikit demi sedikit, dan masukkan
setiap bilasan ke dalam kolom kedua, biarkan mengalir
melalui kolom dan buang eluat yang keluar. Jika heksan
di atas permukaan kolom tersisa lebih kurang 1 ml,
tambahkan 75 ml toluen P dan eluasi dengan bantuan
pompa pengisap (lebih kurang 125 mm raksa) dan
tampung eluat. Uapkan toluen di bawah hampa udara
pada suhu tidak lebih dari 40° atau dengan aliran gas
nitrogen P pada suhu kamar.
Larutan uji Larutkan residu yang diperoleh dari
Kromatografi kolom kedua dalam sedikit etilen diklorida
P, pindahkan ke dalam labu tentukur 10-ml, encerkan
dengan etilen diklorida P sampai tanda, campur untuk
mendapatkan Larutan uji.
Pengembangan warna Pipet 1 ml Larutan uji ke dalam
masing-masing 3 tabung kolorimeter yang sesuai,
berdiameter dalam lebih kurang 20 mm dan diberi tanda
1, 2, 3. Ke dalam tabung 1, pipet 1 ml Larutan baku, ke
dalam tabung 2, pipet 1 ml etilen diklorida P, ke dalam
tabung 3, pipet 1 ml campuran volume sama anhidrida
asetat P dan etilen diklorida P. Pada setiap tabung segera
tambahkan 5,0 ml Pereaksi warna, sebaiknya
memakai pipet otomatis, campur. sesudah 45 detik,
yang diukur saksama, penambahan Pereaksi warna, ukur
serapan ketiga larutan pada 500 nm dengan
spektrofotometer yang sesuai, memakai etilen
diklorida P sebagai blangko. Dengan cara yang sama,
45 detik sesudah pembacaan pertama setiap larutan, ukur
serapan larutan dalam tabung 2 dan 3 pada panjang
gelombang 550 nm. Beri tanda serapan berturut-turut
sebagai A1
500, A2
500, A3
500, A2
550, dan A3
550, superskrip
menampilkan nomor tabung dan subskrip menampilkan
panjang gelombang.
Perhitungan Hitung jumlah μg vitamin D dalam zat
yang dipakai dengan rumus:
S
US
A
A
C
C
Cs yaitu kadar vitamin D, dalam μg per ml Larutan
baku; C yaitu kadar contoh (dalam g, kapsul, tablet, dan
lain-lain), dalam tiap ml larutan akhir; Au memiliki
nilai (A2
500 - A3
500) – 0,67(A2
550 - A3
550) ditetapkan dari
serapan yang diamati pada larutan dari Larutan uji, dan
As memiliki nilai A1
500 - A2
500 ditetapkan pada larutan
dari Larutan baku.
METODE BIOLOGI
Penetapan vitamin D secara biologi terdiri dari
pencatatan dan interpretasi hasil pengamatan pada
sekelompok tikus yang dipelihara dengan makanan
khusus selama suatu periode tertentu, dimana respons
biologi terhadap sediaan, dibandingkan dengan respons
terhadap kapsul vitamin D BPFI.
Baku pembanding Kolekalsiferol BPFI.
Periode pendahuluan Selama periode pendahuluan
pada kehidupan seekor tikus, yang tidak lebih dari
30 hari, dari waktu kelahiran sampai pada hari pertama
periode pemberian makanan, kandang tikus diawasi
langsung, atau sesuai dengan petunjuk penanggung jawab
percobaan. Selama periode pendahuluan, pakailah
makanan yang memberi perkembangan normal namun
kandungan vitamin D terbatas sampai jika diberikan
Makanan rakhitogenik pada periode perlakuan makanan,
tikus akan menderita rakhitis. Pada akhir periode
pendahuluan, sisihkan setiap tikus yang berbobot kurang
dari 44 g atau lebih dari 60 g, atau yang menampilkan
gejala-gejala yang merugikan, penyakit atau abnormalitas
anatomi.
- 1471 -
Periode perlakuan makanan Selama periode
perlakuan makanan yang berlangsung dari akhir periode
pendahuluan sampai hari pertama periode uji, beri setiap
tikus dengan Makanan rakhitogenik dan air secukupnya,
dan jangan diberi makanan atau tambahan makanan lain.
Makanan rakhitogenik Makanan rakhitogenik terdiri
dari campuran yang sama dari kandungan berikut dengan
perbandingan yang ditunjukkan pada tabel berikut.
Makanan rakhitogenik
Kandungan Bagian dalam bobot
Biji jagung kuning, digiling 76
Gluten (zat perekat) gandum, 20
digiling.
Kalsium karbonat 3
Natrium klorida 1
Jika suatu analisa secara kimia dari keseluruhan
makanan menampilkan perbandingan Ca : P kurang dari
4:1 atau lebih dari 5:1, maka jumlah kalsium karbonat
dapat diubah-ubah untuk membuat perbandingan yang
sesuai pada tingkat yang sama dalam rentang ini.
Pengelompokan tikus untuk periode penetapan uji
Kandang dianggap sesuai untuk periode uji, jika masing-
masing tikus dalam kandang menampilkan gejala rakhitis
seperti sendi-sendi yang membesar, terhuyung-huyung
dengan aneh, langkah cepat rakhitis, dengan catatan
periode perlakuan makanan tidak kurang dari 19 hari dan
tidak lebih dari 25 hari. Timbulnya rakhitis dapat juga
dilihat dari ketebalan metafisis rakhitis jika diperiksa
dengan sinar-X atau dengan memakai Uji garis
(akan dijelaskan di bawah) pada tulang kaki salah seekor
tikus dalam masing-masing kandang.
Catat bobot masing-masing tikus, bagi dalam suatu
kelompok dimana setiap tikus diberi makan dosis tertentu
Baku pembanding atau contoh yang akan diuji potensi
vitamin D nya. Untuk masing-masing contoh uji sediakan
satu atau lebih kelompok uji dan tidak kurang dari 2
kelompok baku. Kedua kelompok baku dapat dipakai
untuk uji bersama lebih dari satu contoh uji. Dalam
interval tidak lebih dari 30 hari, sempurnakan
pengelompokkan tikus sesuai dengan desain yang
membagi kandang diantara kelompok untuk mencapai
keseimbangan yang sempurna.
Untuk keseimbangan yang sempurna, setiap kandang
terwakili sama dalam setiap kelompok, pakailah tujuh
atau lebih kandang yang berisi tikus yang telah diberi
makanan, yang jumlahnya paling sedikit yaitu sama
banyak dengan kelompok yang ada. Dari suatu kandang
tertentu, pilih seekor tikus secara acak pada setiap
kelompok di hari yang sama. Jika suatu kandang berisi
tikus sebanyak dua kali kelompok yang ada, pilih seri
tikus kedua dengan cara yang sama. Satu atau dua
kandang terakhir yang dipilih dapat dibagi menjadi
kelompok sedemikian sesampai pada awal periode uji
bobot badan rata-rata setiap kelompok yang telah
sempurna, tidak akan berbeda lebih dari 8 g dari bobot
badan rata-rata setiap kelompok lain.
Dosis uji Pilih dua tingkat dosis Kolekalsiferol BPFI,
yang berbeda sedemikian rupa sampai perbandingan dosis
yang lebih besar terhadap dosis yang lebih kecil tidak
kurang dari 1,5 atau tidak lebih dari 2,5. Pilih satu atau
dua tingkat dosis yang didasarkan pada potensi yang
diduga tunggal untuk masing-masing zat uji. Tingkat
dosis zat uji yaitu setara dengan dosis baku atau dosis
tengah yang sama dengan akar pangkat dua dari hasil dua
tingkat dosis baku.
Pilih tingkat dosis sedemikian sampai jika diberikan
pada tikus rakhitis, tikus ini diharapkan menghasilkan
derajat kalsifikasi dalam rentang seperti dinyatakan pada
uji dari data keberterimaan. Sebelum diberikan, Baku
pembanding, dan atau zat uji dapat diencerkan dengan
minyak biji kapas dengan syarat tidak lebih dari 0,2 ml
yang diberikan pada setiap hari. Simpan larutan minyak
dalam botol tertutup baik, terlindung cahaya, pada suhu
tidak lebih dari 10º, dan pakailah dalam waktu 5 minggu.
Tetapkan satu kelompok tikus untuk setiap tingkat
dosis baku dan dosis satu atau lebih zat uji.
Periode uji Selama periode uji, yang berlangsung dari
akhir periode perlakuan makanan selama interval tetap 7 -
10 hari, kurung masing-masing tikus sendiri-sendiri dan
berikan Makanan rakhitogenik dan air secukupnya.
Berikan Makanan rakhitogenik yang dibuat dari zat yang
sama kepada semua tikus. Pada hari pertama dan hari
ketiga (atau keempat) periode uji, beri setiap tikus
setengah dosis total yang ditetapkan.
Sepanjang periode uji, kondisi lingkungan
dipertahankan seseragam mungkin untuk semua tikus dan
hindari paparan terhadap radiasi antirakhitik. Pada akhir
periode tetap dari 7 - 10 hari, timbang dan bunuh tikus.
Dari tikus-tikus ini yang pada akhir periode
berbobot tidak kurang dari bobot awal periode uji dan
yang sudah menerima dosis yang ditetapkan dalam
24 jam waktu pemberian makan, bedah satu atau lebih
tulang kaki untuk pemeriksaan Uji garis.
Uji garis Ambil ujung proksimal tibia atau ujung distal
radius, dan bersihkan dari jaringan yang melekat, dalam
setiap satu percobaan memakai tulang yang sama
dari semua hewan. Dengan pisau bersih tajam, buat
potongan longitudinal, median melalui penghubung
epifisis dan diafisis pada tempat sama pada setiap tulang.
Bilas kedua bagian dalam air murni, celupkan segera
dalam larutan perak nitrat P (1 dalam 50) selama 1 menit,
dan bilas lagi dalam air murni. Paparkan permukaan
potongan tulang dalam air terhadap cahaya matahari atau
sumber cahaya aktinik lain sampai daerah yang
terkalsifikasi membentuk noda yang jelas tanpa tanda
perubahan warna pada daerah yang tidak terkalsifikasi.
procedure pewarnaan dapat dimodifikasi untuk lebih
membedakan antara daerah terkalsifikasi dan daerah tak
terkalsifikasi.
Angka derajat kalsifikasi metafisis rakhitis pada setiap
tikus, sesuai dengan skala yang memberi respons rata-
rata dan dapat digambarkan sebagai garis lurus terhadap
logaritma dosis.
- 1472 -
Keberterimaan Pengamatan dapat diterima untuk
dipakai dalam perhitungan potensi hanya dari
kelompok yang menampilkan kalsifikasi dua pertiganya
atau lebih, namun tidak kurang dari 7 ekor tikus, paling
tidak sama besar seperti tingkat paling bawah dan tidak
.jpg)
