tukan dengan interpolasi linier. Hal ini digambarkan
pada Gambar 2
Bentuk kurva foto puncak paling mendekati garis lurus
pada 0,606 P dan kontribusi sebagian saluran-saluran lain
terhdap a dapat diperkirakan secara teliti dengan cara
interpolasi. Hitung a dengan persamaan:
c dan d dan juga c’ dan d’ berturut-turut yaitu laju
cacahan saluran tunggal pada kedua sisi dari 0,606 p; D
dan D’yaitu nomor-nomor saluran (lokasi) berturut-turut
d dan d’. Lokasi variabel yang diperlukan pada foto
puncak dapat dilihat pada Gambar 3.
Dari nilai laju cacahan yang telah diketahui pada
saluran dari foto puncak, P, dan lebar puncak pada 0,606
P; a, yaitu fraksi luas foto puncak yang terkalibrasi
yang dapat diperoleh dari hasil kali a x P(aP).
Tahap-tahap perhitungan yang diperlukan untuk
memakai cara di atas yaitu sebagai berikut:
(1) Kurangi foto puncak yang akan diukur dengan
kontribusi Compton dan latar belakang.
(2) Tentukan laju cacahan saluran puncak (laju
cacahan saluran maksimum sesudah dikurangi Compton
dan latar belakang), P.
(3) Kalikan P dengan 0,606, dan tentukan garis
horizontal yang sesuai dengan lebar puncak, a.
(4) Tentukan lebar puncak a, dengan memasukkan
nilai-nilai variabel (diperoleh dengan cara yang
ditunjukkan pada Gambar 3) ke dalam persamaan untuk a.
(5) Bagian luas puncak terkalibrasi yang diinginkan
sama dengan a x P atau F = aP dimana F yaitu bagian
luas puncak yang sebanding dengan laju pancaran sumber
radioaktif.
Metode ini merupakan cara yang cepat dan tepat untuk
penetapan laju emisi sinar gamma dari sumber, sambil
terutama menghindarkan perkiraan subjektif pada bentuk
puncak-puncak ikutan.
Kesalahan yang disebabkan oleh pemakaian laju cacah
saluran maksimum, dari pemakaian maksimum teoritis
atau laju saluran puncak, yaitu sekitar 1,0% jika a = 6
atau lebih besar.
KALIBRASI EFISIENSI FOTO PUNCAK
Radionuklida-radionuklida seperti yang tercantum dalam
Tabel disertai beberapa data peluruhan nuklirnya, tersedia
sebagai baku pembanding. beberapa yang cukup sumber
baku pembanding radioaktif harus dipilih untuk
mendapatkan kurva kalibrasi yang mencakup daerah yang
diinginkan. Jika mungkin, sumber baku radionuklida-
radionuklida yang dianalisa termasuk di dalamnya.
Hitung laju emisi sinar gamma dengan persamaan:
s b
As yaitu aktivitas, dalam peluruhan per detik baku yang
dipakai ; b yaitu jumlah sinar gamma tiap peluruhan
pada energi ini .
Ukur dengan tepat beberapa larutan baku tiap
radionuklida dalam wadah yang sama dan tentukan fraksi
luas foto puncak (F) masing-masing baku.
memakai persamaan p =F/ , hitung efisiensi foto
puncak p dan gambar grafik dalam bentuk log-log antara
p terhadap energi sinar gamma dapat dilihat pada
Gambar 4
- 1584 -
Tabel sifat-sifat Nuklir(1,2)
Emisi
dasar
foton
Energi
(keV)
Foton
per100
peluruhan
Emisi
dasar
foton
Energi (keV) Foton
per100
peluruhan
129I (T1/2 = 1,57x107 tahun) Bobot rata-rata(4) (34,1) (81,3)
(3) 29,8 37,0 165,8 80,0
29,5 29,0 203Hg(T1/2 = 46,6 hari)
33,6 13,2 XL 10,3 5,6
39,6 7,52 72,87 6,27
Bobot rata-rata(4) (31,3) (77,80) 70,83 3,72
241Am(T1/2 = 432,2 tahun) 82,6 2,79
XL 13,9 38,2 Bobot rata-rata(4) (74,6) (12,8)
1
26,4 2,5 1 279,2 81,5
2 59,5 35,9 113Sn-113mIn (T1/2 = 115,1 hari)
109Cd (T1/2 = 464 hari) XL 3,3 9,0
22,2 55,1 24,2 51,5
22,0 29,1 24,0 27,5
24,9 17,8 27,3 17,3
Bobot rata-rata(4) (22,6) (102,0) Bobot rata-rata(4) (24,7) (96,7)
1 88,0 3,72 1 255,1 1,9
195Au (T1/2 = 183 hari) 2 391,7 64,6
66,83 50 85Kr (T1/2 = 10,72tahun)
65,12 29,0 1 514,0 0,43
75,7 21,7 137Cs-137mBa (T1/2 = 30,0 tahun)
Bobot rata-rata(4) (68,25) (100,7) 32,2 3,90
1 30,88 0,83 31,8 2,11
2 98,86 10,9 36,4 1,42
3 129,7 0,89 Bobot rata-rata(4) (32,9) (7,43)
57Co (T1/2 = 270,9 hari) 1 661,6 89,9
Xk 6,5 56,0 94Nb (T1/2 2x104 tahun)
1
14,4 9,5 1 702 100,0
2 122,1 85,6 2 871 100,0
3 136,4 10,6 22Na (T1/2 = 2,60 tahun)
Bobot rata-rata ( 2
+ 3) (4) (125,0) (96,2) H 511 179,78(5)
139Ce (T1/2 = 137,7 hari) 1 1274,5 99,95
33,4 42,6 60Co (T1/2 = 5,27 tahun)
33,0 23,1 1 1173,2(6) 99,88
37,8 15,6 2 1332,5(6) 99,98
1) Untuk tujuan pengukuran sinar gamma atau sinar X radiasi fluoresensi dari perisai timbal (khususnya, sinar X timbal K 76
keV) dapat mempengaruhi hasil kuantitatif. Untuk mengatur efek ini atau menekan radiasi dapat dilakukan dengan cara melapisi timbal
yang terpapar dengan lembaran kadmium setebal antara 0,06 inci dan 0,08 inci; lalu lapisi kadmium dengan tembaga setebal
antara 0,02 inci dan 0,04 inci.
2) Yang biasanya disertakan hanyalah emisi foton yang memiliki limpahan lebih besar atau sama dengan 1%.
3) Notasi K mengacu pada emisi sinar-X
4) Energi rata-rata dan intensitas total yang diukur dari kelompok foton-foton tidak dapat dipisahkan oleh detektor Nal (T1).
5) Untuk intensitas foton ini agar dipakai , seluruh positron yang diemisi harus dihilangkan dari bahan sumber.
6) Riam
- 1585 -
PENETAPAN AKTIVITAS CUPLIKAN
Dengan cara yang sama seperti pada pembuatan kurva
kalibrasi, tentukan luas fotopuncak utama (F) pada
cuplikan atau alikot yang diukur saksama dengan volume
dan wadah yang sama seperti pada baku. Dari kurva
kalibrasi, tentukan harga p untuk radionuklida yang
diukur. Dengan memakai persamaan:
=
p
F
hitung laju emisi sinar gamma ( ). Hitung aktivitas (A)
dari contoh dalam satuan peluruhan per detik dengan
persamaan:
D
b
A =
b yaitu jumlah sinar gamma tiap pelarutan; D yaitu
faktor pengenceran.
Untuk mendapatkan aktivitas dalam satuan μCi atau
mCi, bagi A berturut-turut dengan 3,7 x 104 atau 3,7 x
107. Hubungan di atas berlaku juga untuk aktifitas dari
kapsul atau cuplikan yang tidak diencerkan; dalam hal ini
faktor pengenceran; D yaitu sama.
SPEKTROFOTOMETRI DAN HAMBURAN
CAHAYA <1191>
PENGUKURAN ULTRA VIOLET, CAHAYA TAMPAK,
INFRAMERAH, SERAPAN ATOM, FLUORESENSI,
TURBIDIMETRI, NEFELOMETRI DAN RAMAN
Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu
interaksi antara radiasi elektromagnetik dan molekul atau
atom dari suatu zat kimia. Teknik yang sering dipakai
dalam analisa farmasi meliputi spektroskopi serapan ultra
violet, cahaya tampak, inframerah dan serapan atom.
Pengukuran spektrofotometri di dalam daerah cahaya
tampak, semula disebut kolorimetri, namun istilah
“kolorimetri” lebih tepat dipakai untuk persepsi
tentang warna.
Spektrofotometri fluorosensi merupakan pengukuran
emisi cahaya dari suatu zat kimia selama diberi paparan
ultra violet, cahaya tampak atau radiasi elektromagnetik
lainnya. Pada biasanya cahaya yang diemisikan oleh
larutan yang berfluorosensi memiliki intensitas
maksimum pada panjang gelombang yang biasanya
20 - 30 nm lebih panjang dari panjang gelombang radiasi
eksitasi.
Hamburan cahaya menyangkut pengukuran cahaya
yang dihamburkan akibat tidak homogennya densitas
optik submikroskopis dari larutan dan berguna dalam
penentuan bobot molekul rata-rata sistem polidispersi
dengan jangkauan bobot molekul dari 1000 sampai
beberapa ratus juta. Dua teknik yang sering dipakai
dalam analisa farmasi yaitu turbidimetri dan
nefelometri.
Spektroskopi Raman (hamburan cahaya tidak elastis)
merupakan proses hamburan cahaya yang contoh ujinya
disinari dengan cahaya monokromatik kuat (biasanya
cahaya laser) dan cahaya yang dihamburkan dari contoh
ini dianalisa pergeseran frekuensinya.
Jangkauan panjang gelombang yang tersedia untuk
pengukuran membentang dari panjang gelombang pendek
ultra violet sampai ke inframerah. Untuk mempermudah
acuan, daerah spektrum ini pada garis besarnya dibagi
dalam daerah ultra violet (190 - 380 nm), daerah cahaya
tampak (380 - 780 nm), daerah inframerah dekat
(780 - 3000 nm) dan daerah inframerah (2,5 - 40 m atau
4000 - 250 cm-1).
Kegunaan Komparatif Daerah Spektrum
Untuk sebagian besar bahan farmasi pengukuran
spektrum dalam daerah ultra violet dan cahaya tampak
dapat dilakukan dengan ketelitian dan kepekaan yang
lebih baik daripada dalam daerah inframerah dekat dan
inframerah. jika larutan diamati dalam sel 1 cm
dengan kadar lebih kurang 10 g per ml contoh, sering
menghasilkan serapan sebesar 0,2 - 0,8 di daerah ultra
violet atau cahaya tampak. Di daerah inframerah dan
inframerah dekat, diperlukan kadar berturut-turut sebesar
1 - 10 mg per ml dan sampai 100 mg per ml, untuk
menghasilkan serapan yang memadai; untuk daerah
spektrum ini biasanya dipakai sel dengan panjang
0,01 - 3 mm.
Spektrum ultra violet dan cahaya tampak suatu zat
pada biasanya tidak memiliki derajat spesifikasi yang
tinggi. Walaupun demikian, spektrum ini sesuai
untuk pemeriksaan kuantitatif dan untuk berbagai zat,
spektrum ini bermanfaat sebagai tambahan untuk
identifikasi.
Spektroskopi inframerah dekat, makin sering
dipakai dalam analisa farmasi terutama untuk
identifikasi cepat dengan jumlah contoh yang banyak dan
juga untuk penetapan kadar air.
Daerah inframerah dekat terutama sesuai untuk
penetapan gugus –OH dan –NH, seperti air dalam
alkohol, OH dalam lingkungan amina, alkohol dalam
hidrokarbon, dan amina primer dan sekunder dalam
lingkungan amina tersier.
Spektrum inframerah bersifat khas untuk suatu
senyawa kimia tertentu, dengan pengecualian isomer
optik yang memiliki spektrum identik. Namun
polimorfisme kadang-kadang dapat menyebabkan
perbedaan dalam spektrum inframerah suatu senyawa
tertentu dalam keadaan padat. Seringkali perbedaan kecil
dalam struktur menghasilkan perbedaan yang menonjol
dalam spektra. sebab banyaknya maksimum yang
ada dalam spektra serapan inframerah, kadang-
kadang dimungkinkan untuk melakukan pengukuran
kuantitatif masing-masing komponen dari suatu
campuran yang komposisi kualitatifnya diketahui tanpa
pemisahan terlebih dahulu.
- 1586 -
Spektrum Raman dan spektrum inframerah
memberi data yang serupa, walaupun intensitas
spektranya ditentukan oleh sifat molekul yang berlainan.
Spektroskopi raman dan inframerah memperlihatkan
kepekaan relatif yang berbeda untuk gugus fungsional
yang berbeda, misalnya spektroskopi raman terutama
sensitif terhadap ikatan rangkap C S dan C C, dan
beberapa senyawa aromatik lebih mudah
diidentifikasikan melalui spektra raman. Air memiliki
intensitas spektrum serapan inframerah yang sangat
tinggi, namun spektrum ramannya sangat lemah. Oleh
sebab itu, air hanya memiliki daerah inframerah
terbatas yang dapat dipakai untuk menguji zat terlarut
dalam cairan mengandung air, sedangkan spektrum
raman dari air hampir transparan seluruhnya dan berguna
untuk identifikasi zat yang terlarut. Dua keterbatasan
utama spektroskopi raman yaitu kadar minimum
spesimen yang dapat dideteksi biasanya 10-2 sampai 10-1 M
dan bahwa cemaran yang ada dalam berbagai zat
dapat berfluorosensi serta menggangu deteksi sinyal
Raman yang terhamburkan.
Pengukuran reflektansi optikal memberi informasi
spektral yang serupa dengan yang diperoleh pada
pengukuran transmisi. Oleh sebab pengukuran
reflektansi hanya memeriksa komposisi permukaan
contoh ini , kesulitan yang berkaitan dengan
ketebalan optik serta sifat hamburan cahaya dari zat
ini tereliminasi. Dengan demikian, sering kali
pengukuran reflektansi dapat dilakukan dengan lebih
sederhana pada bahan yang serapannya intensif. Suatu
teknik yang biasa dipakai untuk pengukuran
reflektansi inframerah dinamakan reflektansi total
teratenuasi (RTA), juga dikenal sebagai reflektansi
internal ganda (RIG). Dalam teknik RTA, berkas
spektrofotometri inframerah dilewatkan melalui bahan
jendela inframerah yang sesuai (misal KRS-5, suatu
campuran etetik TIBr-TII), yang dipotong pada sudut
sedemikian sesampai berkas inframerah memasuki
permukaan pertama (depan) jendela, namun terefleksi
secara total jika berkas itu jatuh pada permukaan
kedua (belakang) (artinya sudut jatuh radiasi pada
permukaan yang kedua dari jendela melampaui sudut
kritis untuk bahan ini ). Dengan konstruksi jendela
yang tepat, memungkinkan untuk memperoleh banyak
refleksi internal dari berkas inframerah sebelum berkas
ditransmisikan keluar jendela. Jika contoh ditempatkan
melekat erat pada jendela sepanjang sisi yang merefleksi
cahaya inframerah secara total, maka intensitas radiasi
yang direfleksikan berkurang pada tiap panjang
gelombang (frekuensi) yang diserap oleh contoh. Dengan
demikian bila dibandingkan dengan pengukuran
reflektansi sederhana, teknik RTA menghasilkan
spektrum reflektansi yang bertambah intensitasnya
sebanyak jumlah reflektansi berkas inframerah dalam
jendela. Teknik RTA memberi kepekaan yang baik,
akan namun keberulangannya tidak baik dan bukan
merupakan teknik kuantitatif yang dapat diandalkan,
kecuali bila dipakai baku internal yang dicampurkan
dengan baik sekali dengan setiap contoh uji.
Spektrofotometri fluoresensi sering kali lebih sensitif
daripada spektrofotometri serapan. Dalam pengukuran
serapan, transmitan contoh dibandingkan dengan
transmisi blangko; dan pada kadar rendah, larutan
keduanya memberi sinyal yang tinggi. Sebaliknya,
pada spektrofotometri fluoresensi blangko pelarut
memberi luaran yang rendah, sesampai radiasi latar
belakang tidak menggangu penetapan pada kadar rendah
menjadi berkurang. Hanya ada sedikit senyawa yang
dapat ditetapkan dengan baik sekali pada kadar dibawah
10-5 M dengan serapan cahaya, namun tidak luar biasa
untuk memakai kadar dari 10-7 M sampai 10-8 M
dalam spektrofotometri fluoresensi.
Teori dan Istilah
Daya dari suatu berkas radiasi akan berkurang
sehubungan dengan jarak yang ditempuhnya melalui
medium penyerap. Daya ini juga akan berkurang
sehubungan dengan kadar molekul atau ion yang terserap
dalam medium ini . Kedua faktor ini
menentukan proporsi dari kejadian total energi yang
timbul. Penurunan daya radiasi monokromatis yang
melalui medium penyerap yang homogen dinyatakan
secara kuantitatif oleh Hukum Beer, log10 (1/T) = A =
abc; istilah ini didefinisikan sebagai berikut:
Serapan [Simbol: A] Logaritma dasar 10 dari kebalikan
transmitans (T). [Catatan Istilah yang dipakai
sebelumnya meliputi densitas optik; absorbansi dan
ekstingsi.]
Daya serap [Simbol: a] yaitu hasil bagi serapan (A)
dibagi dengan hasil perkalian kadar yang dinyatakan
dalam g per liter zat (c) dan panjang sel dalam cm (b).
[Catatan Jangan dirancukan dengan indeks
absorbansi; ekstingsi spesifik atau koefisien ekstingsi]
Daya serap molar [Simbol: ] Hasil bagi serapan (A)
dengan hasil perkalian kadar zat, dinyatakan dalam mol
per liter, dengan panjang serapan dalam cm. [Catatan:
Istilah yang dipakai sebelumnya meliputi indeks
serapan molar, koefisien ekstingsi molar dan koefisien
serapan molar.]
Untuk sebagian besar sistem yang dipakai dalam
spektrofotometri serapan, daya serap suatu zat merupakan
konstanta yang tidak tergantung pada intensitas radiasi
datang, panjang sel bagian dalam dan kadar, dengan
demikian kadar dapat ditetapkan secara fotometri.
Hukum Beer tidak menampilkan adanya pengaruh
suhu, panjang gelombang atau jenis pelarut. Untuk
sebagian besar analisa pengaruh variasi suhu yang
normal dapat diabaikan.
Penyimpangan dari Hukum Beer dapat disebabkan oleh
variabel kimia atau instrumen. Kegagalan Hukum Beer
dapat disebabkan oleh perubahan kadar molekul terlarut
sebagai akibat penggabungan antar molekul terlarut atau
penggabungan antara molekul terlarut dan molekul
pelarut, atau disosiasi atau ionisasi. Penyimpangan lain
dapat disebabkan oleh pengaruh instrumen seperti radiasi
polikromatis, pengaruh lebar celah atau cahaya yang
menyimpang.
- 1587 -
Bahkan pada suhu tertentu dalam pelarut tertentu, daya
serap tidak benar-benar konstan. Walaupun demikian
dalam hal contoh hanya memiliki satu komponen yang
menyerap, tidak perlu sistem serapan ini memenuhi
Hukum Beer untuk dipakai dalam analisa kuantitatif.
Kadar yang tidak diketahui dapat diperoleh dengan
membandingkan dengan suatu kurva baku yang
ditetapkan secara eksperimental.
Meskipun dalam pengertian yang eksak, Hukum Beer
tidak berlaku dalam spektrofotometri serapan atom
sebab kurang pastinya panjang sel dan kadar, proses
penyerapan yang terjadi dalam nyala api pada kondisi
aspirasi yang berulang kembali, pada prinsipnya
mengikuti Hukum Beer ini . Khususnya logaritma
negatif dari transmitans atau serapan berbanding lurus
dengan koefisien absorpsi, jadi berbanding lurus dengan
banyaknya atom yang menyerap. Atas dasar ini, kurva
kalibrasi dapat dibuat untuk evaluasi nilai serapan yang
tidak diketahui dalam arti kadar zat dalam larutan.
Spektrum serapan Suatu penampilan dalam bentuk
grafik dari serapan atau fungsi dari serapan terhadap
panjang gelombang atau suatu fungsi dari panjang
gelombang.
Transmitan [Simbol: T] Hasil bagi daya radiasi yang
ditransmisikan oleh contoh dengan daya radiasi yang
jatuh pada contoh ini . [Catatan Istilah yang
dipakai sebelumnya termasuk transmitansi dan
transmisi.]
Intensitas fluoresensi [Simbol: I] Suatu pernyataan
empiris dari aktivitas fluoresensi, biasanya diberikan
dalam unit berubah-ubah yang sebanding dengan respon
detektor. Spektrum emisi fluoresensi merupakan suatu
penyajian grafik dari distribusi spektrum radiasi yang
diemisikan oleh suatu zat yang diaktifkan, yang
menampilkan intensitas radiasi yang diemisikan sebagai
ordinat dan panjang gelombang sebagai absis. Spektrum
eksitasi fluoresensi merupakan penyajian grafik dari
spektrum aktivasi yang menampilkan intensitas radiasi
yang diemisikan oleh zat yang diaktifkan sebagai ordinat
dan panjang gelombang radiasi yang mengaktifkan
sebagai absis. Seperti dalam spektrofotometri serapan,
daerah penting spektrum elektromagnetik yang dicakup
oleh fluoresensi senyawa organik yaitu daerah ultra
violet, cahaya tampak, dan inframerah dekat, yaitu daerah
dari 250 - 800 nm. sesudah molekul menyerap radiasi,
energi dapat hilang sebagai panas atau dibebaskan dalam
bentuk radiasi dengan panjang gelombang yang sama
atau lebih panjang dari radiasi yang diserap. Baik serapan
maupun emisi radiasi keduanya disebabkan oleh transisi
elektron diantara tingkat energi atau orbital yang berbeda
dari molekul. ada penundaan waktu antara serapan
dan emisi cahaya; interval waktu ini, yang menyatakan
panjangnya waktu keadaan tereksitasi ini
berlangsung, telah diukur lamanya lebih kurang 10-9 detik
sampai 10-8 detik untuk sebagian besar larutan organik
yang berflouresensi. Umur fluoresensi yang pendek
ini membedakan tipe luminesensi dari fosforesensi
yang umurnya panjang, dari 10-3 detik sampai beberapa
menit.
Turbidansi [Simbol: S] Efek hamburan cahaya dari
partikel yang tersuspensi. Jumlah zat yang tersuspensi
dapat diukur dengan mengamati cahaya yang
ditransmisikan (turbidimetri) atau yang dihamburkan
(nefelometri).
Turbiditas [Simbol: ] Pada pengukuran hamburan
cahaya, turbiditas merupakan ukuran bagi berkurangnya
intensitas berkas datang per unit panjang suatu suspensi
tertentu.
Aktivitas hamburan Raman. Sifat molekul (dalam unit
cm4 per g) yang menentukan intensitas pita Raman yang
diamati untuk suatu contoh berorientasi acak. Aktivitas
hamburan ditentukan dari derivatif kemampuan
polarisasi molekul terhadap gerak molekul yang
menimbulkan pita pergeseran Raman. Pada biasanya ,
intensitas pita Raman berbanding lurus dengan kadar
analit.
pemakaian Baku Pembanding
Dengan beberapa pengecualian, pengujian dan
penetapan kadar secara spektrofotometri pada Farmakope
memerlukan Baku Pembanding FI. Hal ini untuk
memastikan bahwa pengukuran dilakukan pada kondisi
yang sama untuk contoh uji dan zat pembanding. Kondisi
ini mencakup penetapan panjang gelombang,
pengaturan lebar celah, penempatan sel dan koreksi sel
serta aras transmitannya. Perlu dicatat bahwa sel yang
menampilkan transmitan yang identik pada panjang
gelombang tertentu dapat sangat berbeda transmitansinya
pada panjang gelombang yang lain. Harus ditetapkan dan
dilakukan koreksi sel yang tepat jika diperlukan.
Pernyataan “sediaan yang serupa” dan “larutan yang
serupa” seperti yang dipakai dalam pengujian dan
penetapan kadar secara spektrofotometri, menampilkan
bahwa bahan pembanding ini yaitu Baku
Pembanding FI, yang disiapkan dan diamati dengan cara
yang praktis sama dengan yang dipakai untuk contoh
uji. Biasanya dalam membuat larutan Baku Pembanding
yang ditentukan, larutan disiapkan dengan kadar lebih
kurang (sampai 10%) seperti yang diinginkan dan serapan
jenis dihitung berdasarkan jumlah tepat yang ditimbang;
jika tidak dipakai bahan Baku Pembanding yang telah
dikeringkan sebelumnya, serapan jenis dihitung terhadap
zat anhidrat.
Pernyataan “tetapkan secara bersamaan” dan “ukur
bersamaan” seperti yang dipakai dalam pengujian dan
penetapan kadar secara spektrofotometri, memberi
petunjuk bahwa serapan larutan zat uji dan larutan zat
pembanding, yang ditetapkan terhadap blangko, harus
diukur berturut-turut dengan segera.
PERALATAN
Tersedia beberapa jenis spektrofotometer. Pada
dasarnya, biasanya jenis spektrofotometer melewatkan
energi radiasi monokromatis ke contoh dalam bentuk
yang sesuai, dan mengukur intensitas dari fraksi yang di
transmisi, kecuali pada spektrofotometer IR.
Spektrofotometer Fouirer Transform Infrared (FTIR)
- 1588 -
memakai teknik interferometri dimana radiasi
polikromatis melewati analit ke dalam detektor
berdasarkan intensitas dan waktu. Spektrofotometer UV,
cahaya tampak dan IR dispersif terdiri dari sumber
energi, alat dispersi (misal prisma atau gratting), celah
untuk seleksi pita panjang gelombang, sel atau wadah
untuk zat uji, detektor energi radiasi, dilengkapi dengan
amplifier dan alat pengukur. Pada spektrofotometer dioda
array, energi dari sumber melewati zat uji dan lalu
didispersikan melalui gratting ke dalam beberapa ratus
dioda peka cahaya yang masing-masing membentuk
sinyal foton pada rentang panjang gelombang yang kecil,
sinyal ini lalu dikomputerisasi dengan cepat
pada rentang terpilih yang mempresentasikan spektrum
lengkap. Sistem FTIR memakai interferometer
menggantikan alat dispersi dan komputer digital untuk
memproses data spektra. Beberapa instrumen
dioperasikan secara manual, sedangkan yang lainnya
dioperasikan dengan otomatis dan merekam secara
berkesinambungan. Alat yang digabungkan dengan
komputer memiliki kemampuan untuk menambah dan
menyimpan spektra menampilkan perbandingan spektra,
dan menampilkan perbedaan dengan spektroskopi
(penyelesaian dengan pemakaian metode pengurangan
absorbansi digital).
Alat–alat ini dapat dipakai pada daerah
spektrum cahaya tampak; cahaya tampak dan ultra violet
(UV); cahaya tampak, UV dan inframerah (IR) dekat; dan
pada daerah IR spektrum. Pemilihan jenis analisa
spektrofotometri dan alat yang dipakai tergantung
pada berbagai faktor seperti komposisi dan jumlah contoh
uji yang tersedia, derajat akurasi, sensitivitas, dan
selektifitas yang dikehendaki, dan perlakuan terhadap
contoh uji.
Alat yang dipakai pada spektrofotometer serapan
atom memiliki beberapa kemampuan khusus. Untuk
tiap elemen yang ditetapkan sumber yang spesifik
mengemisikan garis spektra untuk diserap harus dipilih.
Sumber biasanya yaitu lampu hollow katoda, suatu
katoda yang dirancang untuk mengemisikan radiasi yang
dikehendaki pada kondisi tereksitasi. Saat radiasi diserap
oleh elemen contoh uji, biasanya pada panjang
gelombang yang sama dengan garis emisinya, elemen
pada lampu hollow katoda sama dengan elemen yang
ditetapkan. Alat dilengkapi dengan aspirator untuk
membawa contoh uji ke dalam nyala, yang biasanya
dihasilkan dari udara-asetilena, udara-hidrogen atau untuk
kondisi refraktori, nitrogen oksida-asetilena. Nyala
berpengaruh pada pemanasan bejana uji. Detektor
dipakai untuk membaca sinyal dari bejana uji.
Gangguan radiasi dari nyala selama pembakaran dapat
ditiadakan dengan pemakaian sinyal yang terputus-putus
dari lampu sumber pada frekuensi yang ditentukan.
Detektor harus berada pada frekuensi alternatif supaya
sinyal langsung yang berasal dari nyala diabaikan. Sistem
deteksi, hanya membaca perubahan sinyal dari sumber
hollow katoda, yang berbanding langsung dengan jumlah
atom yang ditetapkan dari contoh uji. Untuk kebutuhan
pemeriksaan obat, dipersyaratkan alat yang dapat
membaca unit serapan secara langsung. Alat yang
membaca persen transmitan, persen serapan atau
konsentrasi dapat dipakai jika rumus perhitungan yang
tertera pada masing-masing monografi disesuaikan
sesampai memberi hasil kuantitatif. Persen serapan
atau persen transmitan diubah menjadi serapan, A,
dengan rumus sebagai berikut:
A = 2- log10 (100 - % serapan)
atau
A= 2- log10 (% transmitan)
Pembacaan alat dengan pengukur meter, pencacah
digital, perekam atau printer, tergantung dari jenis alat
yang dipakai . Alat cahaya tunggal atau cahaya ganda
yang tersedia dipasaran keduanya dapat dipakai .
Pengukuran intensitas fluorosensi dapat dilakukan
dengan suatu fluorometer penyaring sederhana. Alat
semacam itu terdiri dari sumber radiasi; penyaring
primer, bejana uji, penyaring sekunder dan sistem deteksi
fluorosensi. Pada jenis fluorometer ini, detektor
ditempatkan di atas sebuah sumbu yang membentuk
sudut 90° dengan berkas eksitasi. Geometri sudut siku ini
memungkinkan radiasi eksitasi menembus contoh uji
tanpa mengkontaminasi sinyal luaran yang diterima oleh
detektor fluorosensi. Akan namun tidak dapat dihindarkan
detektor menerima beberapa radiasi eksitasi sebagai
akibat sifat menghamburkan yang ada pada larutan itu
sendiri atau adanya debu atau padatan lainnya. Penyaring
dipakai untuk menghilangkan sisa hamburan ini .
Penyaring utama menyeleksi radiasi dengan panjang
gelombang pendek yang sanggup mengeksitasi contoh
uji, sedangkan penyaring kedua biasanya merupakan
suatu penyaring yang lebih halus sesampai melewatkan
fluoresensi dengan panjang gelombang yang lebih
panjang namun menahan hamburan eksitasi.
Pada biasanya fluorometer memakai tabung-
tabung pengganda cahaya sebagai detektor, tersedia
banyak tipe dan masing-masing memiliki sifat khusus
yaitu daerah spektra dengan kepekaan maksimum,
keuntungan dan derau elektrik. Cahaya yang diteruskan
diperkuat dan dibaca pada sebuah meter atau rekorder.
Spektrofluorometer berbeda dengan fluorometer
penyaring, dimana penyaring diganti dengan
monokromator dari prisma atau gratting. Untuk
pemakaian analitikal, spektrofluorometer lebih unggul
dari fluorometer penyaring dalam pemilihan panjang
gelombang; fleksibilitas dan kemudahan, dalam hal yang
sama spektrofotometer lebih unggul dari fotometer
penyaring.
Banyak tersedia sumber radiasi, lampu merkuri relatif
stabil dan memancarkan energi terutama pada panjang
gelombang terpisah. Lampu tungsten memberi energi
terus menerus pada daerah cahaya tampak. Lampu xenon
bertekanan tinggi sering dipakai pada
spektrofluorometer sebab merupakan sumber dengan
intensitas tinggi yang dapat mengemisikan energi secara
terus-menerus dari ultra violet sampai inframerah.
- 1589 -
Pada spektrofluorometer, monokromator dilengkapi
dengan celah. Celah yang sempit menghasilkan resolusi
tinggi dan kemurnian spektra, sedangkan celah yang
besar mengorbankan hal ini untuk kepekaan yang
tinggi. Pemilihan ukuran celah berdasarkan pemisahan
diantara panjang gelombang eksitasi dan emisi, begitu
juga tingkat kepekaan yang dibutuhkan.
Sel contoh yang dipakai pada pengukuran
fluorosensi berupa tabung bulat atau persegi panjang
sama seperti pada pemakaian spektrofotometri serapan,
kecuali keempat sisi vertikalnya dipoles. Ukuran contoh
uji biasanya 2 - 3 ml, namun beberapa alat dapat
memakai sel kecil dengan volume 100 - 300 L atau
dengan pemegang pipa kapiler yang dapat menampung
jumlah lebih kecil contoh uji.
Alat hamburan cahaya yang tersedia biasanya terdiri
dari lampu merkuri, dengan penyaring untuk cahaya hijau
atau biru kuat, sebuah alat pengatur paparan cahaya,
seperangkat penyaring netral yang sudah diketahui
transmitannya, dan pengganda cahaya yang peka yang
ditempatkan pada lengan yang dapat mengitari sel larutan
dan dapat diatur pada suatu sudut dari -135° sampai 0°
sampai +135° oleh sebuah piringan di luar kotak
penyimpanan yang kedap cahaya. Sel larutan bentuknya
bermacam-macam, misalnya persegi untuk mengukur
hamburan 90°, semioktagonal untuk hamburan 45°, 90°
dan 135°, dan silindris untuk hamburan pada semua
sudut. Oleh sebab penetapan bobot molekul memerlukan
pengukuran secara tepat perbedaan indeks refraksi
diantara larutan dan pelarut [(n-no)/C], maka diperlukan
alat kedua, sebuah refraktometer diferensial, untuk
mengukur perbedaan yang kecil ini .
Spektrometri raman terdiri dari komponen utama
sebagai berikut: sumber cahaya radiasi monokromatis
(berbagai sinar laser); optik untuk mengumpulkan
hamburan cahaya pada contoh uji; monokromator ganda
untuk mendispersikan hamburan cahaya dan
menghilangkan intensitas kejadian; sistem penguatan dan
detektor cahaya yang sesuai. Pengukuran raman
sederhana pada sebagian besar contoh uji dengan
mengukur titik lebur memakai kapiler secara
langsung. sebab sumber laser dapat difokuskan secara
tepat, hanya membutuhkan beberapa mikroliter contoh uji.
procedure
SPEKTROFOTOMETRI SERAPAN
Petunjuk operasional rinci dari spektrofotometer
diberikan oleh pabrik. Untuk mendapatkan hasil yang
absah, operator harus memahami keterbatasan, sumber
kesalahan potensial dan variasi alat. Petunjuk pemakaian
untuk pemeliharaan, pembersihan, dan kalibrasi alat serta
teknik penanganan sel serapan harus diikuti sesuai
petunjuk operasi. Hal-hal berikut ini penting untuk
diperhatikan.
Periksa instrumen untuk ketepatan kalibrasi. Jika
dipakai sumber radiasi yang berkesinambungan, harus
diperhatikan panjang gelombang dan skala
fotometriknya; jika dipakai sumber garis spektra, yang
harus diperiksa hanya skala fotometrik. beberapa sumber
energi radiasi yang memiliki garis spektra yang sesuai
intensitasnya, memiliki ruang yang cukup pada rentang
spektra yang dipilih. Sumber spektra kalibrasi tunggal
untuk UV dan cahaya tampak yang terbaik yaitu lampu
merkuri-kuarsa, memakai panjang gelombang 253,7;
302,25; 313,16; 334,15;365,48; 404,66 dan 435,83 nm.
Merkuri-kaca juga dipakai diatas 300 nm. Panjang
gelombang 486,13 dan 656,28 nm dapat juga dipakai
untuk lampu hidrogen. Skala panjang gelombang dapat
dikalibrasi dengan kaca penyaring yang sesuai, yang
dipakai pada pita serapan daerah UV dan cahaya
tampak. Kaca baku yang mengandung didinium
(campuran proseodimium dan neodimium) banyak
dipakai meskipun kaca yang mengandung holmium
lebih baik. Larutan baku holmium oksida telah
menggantikan pemakaian kaca holmium. Skala panjang
gelombang spektrofotometer IR dekat dan IR diperiksa
memakai pita serapan dari film polistirena,
karbondioksida, uap air atau gas amonia.
Untuk memeriksa skala fotometrik dapat dipakai ,
beberapa penyaring anorganik baku yang sama baiknya
dengan larutan baku yang diketahui transmitannya seperti
kalium bikromat.
Pengukuran serapan kuantitatif biasanya
memakai larutan zat pada sel penahan cairan. sebab
pelarut dan jendela sel keduanya menyerap cahaya, harus
dilakukan koreksi pada pengukuran serapan. Sel
pembanding untuk spektrofotometer UV dan cahaya
tampak yang tidak memerlukan sel koreksi tersedia di
pasaran. Pada spektrofotometer IR, koreksi untuk
perbedaan sel harus dilakukan. Pada beberapa masalah ,
sepasang sel diisi dengan pelarut yang dipilih dan
ditentukan perbedaan serapannya pada panjang
gelombang yang dipilih. Sel yang dipakai untuk
larutan uji yaitu yang menampilkan serapan lebih besar
dan pengukuran serapan harus dikoreksi dengan
mengurangkan perbedaan sel.
Pada FTIR yang terkomputerisasi koreksi tidak
diperlukan sebab dapat dipakai sel yang sama untuk
blangko dan larutan uji. namun , harus dipastikan bahwa
transmisi sel konstan.
Perbandingan contoh uji dengan baku pembanding
memakai puncak serapan spektra sangat baik untuk
zat yang dikehendaki. Penetapan kadar memakai
spektrofotometri biasanya memakai panjang
gelombang untuk puncak serapan spektra zat yang diuji.
Spektrofotometer yang berbeda menampilkan perbedaan
yang kecil pada puncak panjang gelombang yang nyata.
Untuk hasil yang baik membutuhkan pembandingan pada
panjang gelombang serapan maksimum. Jika perbedaan
lebih dari ±1 nm dari panjang gelombang yang tertera
pada monografi, maka perlu dilakukan rekalibrasi.
Larutan uji
Untuk penetapan memakai spektrofotometer UV
atau cahaya tampak, biasanya contoh uji dilarutkan ke
dalam suatu pelarut. Jika tidak dinyatakan lain dalam
- 1590 -
monografi, penetapan dilakukan pada suhu ruang
memakai panjang lumen 1 cm. Sebagian besar
pelarut sesuai untuk rentang ini, termasuk air, alkohol,
kloroform, hidrokarbon rantai pendek, eter dan pelarut
asam dan basa kuat. Harus diperhatikan agar pelarut yang
dipakai bebas dari kontaminan yang memberi
serapan pada daerah spektra yang dipakai . Biasanya
disarankan memakai pelarut metanol atau alkohol
bebas air, atau alkohol yang didenaturasi dengan
penambahan metanol namun tidak mengandung benzena
atau cemaran pengganggu lainnya. Pelarut dengan
kualitas khusus untuk spektrofotometri yang terjamin
bebas kontaminasi banyak tersedia dipasaran dari
berbagai pabrik. Beberapa pelarut organik kualitas analisa
lain mungkin mengandung cemaran dalam jumlah kecil
yang mennyerap kuat pada daerah UV. Lot baru dari
pelarut ini harus di periksa dan pemakaian lot yang sama
pelarut ini untuk penyiapan larutan uji dan larutan
baku serta blangko harus dilakukan secara hati-hati.
Tidak ada pelarut dengan ketebalan yang cukup
transparan secara sempurna pada semua daerah spektra
IR dekat dan spektra IR. Karbon tetraklorida (ketebalan
5 mm) praktis transparan sampai 6 m (1666 cm-1).
Karbon disulfida (ketebalan 1 mm) sesuai sebagai pelarut
sampai 40 m (250 cm-1) dengan pengecualian pada
daerah 4,2 m sampai 5,0 m (2381 cm-1 sampai 2000
cm-1) dan 5,5 m sampai 7,5 m (1819 cm-1 sampai 1333
cm-1), dimana karbon disulfida memiliki serapan yang
kuat. Pelarut lain memiliki daerah transparan yang
relatif sempit. Untuk spektrofotometri IR, penambahan
kualifikasi untuk pelarut yang sesuai yaitu harus tidak
memberi pengaruh pada zat, biasanya dipakai
natrium klorida sebagai sel. Contoh uji disiapkan dengan
mendispersikan serbuk halus zat padat contoh pada
minyak mineral atau dengan mencampur homogen
sebelumnya dengan garam halida alkali yang telah
dikeringkan sebelumnya (biasanya dipakai kalium
bromida). Campuran dengan garam halida alkali
ditetapkan langsung atau dengan cakram atau pelet
transparan dengan cara mengempa campuran pada
cetakan. Kondisi pengeringan untuk kalium bromida
yaitu 105º dengan vakum selama 12 jam, walaupun
tersedia kalium bromida yang tidak membutuhkan
pengeringan. Mikroskopi inframerah atau dispersi minyak
mineral lebih disukai bila ketidakproporsionalan antara
halida alkali dan contoh uji. Contoh uji untuk mikroskopi
inframerah disiapkan dengan ketipisan yang tepat, dan
untuk dispersi dalam minyak mineral zat uji
disuspensikan sebagai lapisan tipis. Untuk spektrometri
raman, banyak pelarut yang sesuai, dan sel kaca zat uji
yang normal (tidak berfluoresensi) dapat dipakai .
Daerah spektra IR elektromagnetik 0,8 - 400 m. Dari
800 - 2500 nm (0,8 - 2,5 m) biasanya dianggap sebagai
daerah IR dekat, 2,5 sampai 25 m (4000 - 400 cm-1)
pada daerah IR tengah, dan 25 sampai 400 m biasanya
dianggap sebagai daerah IR jauh. Jika tidak dinyatakan
lain pada monografi, daerah 3800 sampai 650 cm-1
(2,6 - 15 m) dipakai untuk memastikan pemenuhan
spesifikasi monografi serapan IR.
Jika nilai panjang gelombang IR diberikan pada
masing-masing monografi, huruf s,m,w menampilkan
serapan kuat, serapan sedang dan serapan lemah, sh
yaitu pundak, bd yaitu pita, dan v yaitu banyak. Nilai
bervariasi dari 0,1 m atau 10 cm-1, tergantung pada jenis
alat yang dipakai . Polimorfisme memberi
peningkatan variasi pada spektra IR dari beberapa
senyawa dalam bentuk padat. Pada pengujian dengan
serapan IR, jika ada perbedaan antara spektra IR dari
analit dengan baku, larutkan beberapa bagian yang sama
zat uji dan baku ke dalam beberapa volume yang sama
pelarut yang sesuai, uapkan larutan sampai kering pada
wadah yang serupa dengan kondisi yang identik, dan
ulangi pengujian memakai residu yang diperoleh.
Spektroskopi IR dekat saat ini sangat disukai sebab
pengujian yang mudah. Zat uji dianalisa dalam bentuk
serbuk atau dengan teknik reflektansi memakai
sedikit atau tanpa perlakuan. Pemenuhan spesifikasi
laboratorium dapat ditentukan dengan membandingkan
spektra dengan spektra sebelumnya yang diperoleh dari
baku pembanding. Beberapa bahan obat menampilkan
daya serap yang rendah pada daerah spektra ini yang
dapat menimbulkan radiasi IR dekat yang berpenetrasi ke
dalam zat uji lebih dalam dari pada radiasi ultra violet,
cahaya tampak dan IR. Spektrofotometri IR dekat dapat
dipakai untuk mengamati modifikasi matriks, dan
dengan kalibrasi yang baik dapat dipakai untuk
analisa kuantitatif.
Pada spektrofotometri serapan atom, sifat pelarut dan
konsentrasi zat padat harus menjadi pertimbangan
khusus. Pelarut yang ideal yaitu yang memberi
gangguan minimal baik pada serapan maupun emisi dan
menghasilkan atom netral pada nyala. Jika ada
perbedaan yang menonjol antara tegangan permukaan
atau viskositas dari larutan uji dan larutan baku, larutan
diaspirasi atau diatomisasi pada kecepatan yang berbeda
yang menyebabkan perbedaan yang menonjol dari sinyal
yang dihasilkan. Konsentrasi asam dari larutan juga
berpengaruh pada proses penyerapan. Pelarut yang
dipakai pada penyiapan zat uji dan baku harus sama
atau sebisa mungkin serupa dan larutan hasil harus dapat
dengan mudah diaspirasi melalui tabung zat uji dari
pembakar aspirator. sebab zat yang tidak larut dalam
larutan memberi peningkatan gangguan. Kandungan
total zat padat yang tidak larut pada semua larutan
sedapat mungkin dibawah 2%.
Perhitungan
pemakaian spektrofotometri serapan dalam
penetapan kadar dan pengujian umum mempersyaratkan
pemakaian baku pembanding. Beberapa pengukuran,
terutama pada penetapan kadar, rumus yang ada
dipakai untuk menghitung hasil yang diinginkan.
Bilangan konstanta biasanya termasuk dalam rumus.
Penurunan rumus berikut menampilkan pendekatan
logika pada penetapan konstanta yang ada pada
rumus penetapan kadar yang tertera pada beberapa
monografi.
- 1591 -
Hubungan hukum Beer absah untuk larutan baku (S)
dan larutan uji (U)
(1) ss abCA =
(2) uu abCA =
As yaitu serapan larutan baku, Cs yaitu konsentrasi
larutan baku, Au yaitu serapan larutan uji dan Cu yaitu
konsentrasi larutan uji. Jika Cs dan Cu ditunjukkan dengan
unit yang sama dan serapan dari kedua larutan diukur
memakai sel pembanding memiliki dimensi yang
sama, daya serap, a dan ketebalan sel, b, sama, maka
kedua rumus dapat digabung, untuk menetapkan Cu
(3)
s
u
su A
ACC =
Jumlah contoh uji bentuk padat yang dipakai
untuk analisa biasanya dinyatakan dalam mg. Petunjuk
pengenceran diberikan pada penetapan kadar dan
konsentrasi enceran larutan yang dipakai untuk
pengukuran serapan, biasanya dinyatakan dalam g per
ml. Jumlah dalam mg contoh uji dari senyawa obat atau
bentuk sediaan padat untuk analisa , mengikuti volume
(Vu) dalam L, konsentrasi (Cu) yang didapat dari jumlah
zat uji yang terkandung dalam bobot (Wu) dalam mg dari
senyawa obat [Catatan Cu dinyatakan dalam g per ml
atau mg per L]
(4) uuu CVW =
Bentuk rumus yang ditunjukkan pada penetapan kadar
dalam monografi zat padat dapat diturunkan dengan
mengganti Cu pada rumus (3) ke dalam rumus (4). Pada
rangkuman dipakai rumus (4) dengan pertimbangan
keperluan konversi beberapa unit untuk mencapai
kesamaan pada rumus (5), Lakukan perhitungan faktor
konstanta (Vu) sampai diperoleh rumus akhir
(5)
s
u
suu A
ACVW =
Penurunan yang sama dipakai pada rumus yang
tertera pada monografi untuk zat cair yang penetapan
kadarnya memakai spektrofotometri serapan. Untuk
sediaan cair, hasil perhitungan biasanya dinyatakan
dalam jumlah mg bahan obat tiap ml sediaan. Jadi perlu
untuk memasukkan dalam rumus tambahan persyaratan
volume (V) dalam ml larutan uji yang dipakai .
Penetapan kadar pada daerah sinar tampak biasanya
untuk membandingkan kesesuaian serapan Larutan uji
dan Larutan baku yang mengandung beberapa BPFI yang
lebih kurang sama. Pada keadaan tertentu, dibolehkan
tidak memakai baku pembanding. Hal ini dapat
dilakukan jika penetapan kadar dengan spektrofotometri
dipakai untuk analisa rutin dan tersedia kurva baku,
yang dibuat dari BPFI sebelumnya dan jika penetapan
kadar memenuhi hukum Beer dalam rentang antara 75%
sampai 125% konsentrasi akhir yang dipakai untuk
penetapan kadar. Dalam hal ini, serapan yang didapat
pada penetapan kadar dapat diinterpolasikan pada kurva
baku dan hasil penetapan kadar dihitung dari kurva baku.
Kurva baku harus selalu dikonfirmasi secara teratur,
dan dibuat baru pada pemakaian spektrofotometer baru
atau pereaksi dengan lot baru.
Penetapan kadar secara spektrofotometri lebih baik
dilakukan dengan penyiapan langsung dan memakai
kurva baku. Jika penetapan kadar dilakukan tidak rutin,
jangan pakailah kurva baku namun memakai
perbandingan langsung dengan baku pembanding yang
jumlahnya lebih kurang sama dengan zat uji dan
diperlakukan sama.
SPEKTROFOTOMETRI FLUORESENSI
Pengukuran dengan fluoresensi merupakan teknik
analisa yang berguna. Fluoresensi yaitu emisi cahaya
dari senyawa dalam keadaan tereksitasi yang dicapai
dengan menyerap energi radiasi. Senyawa ini
disebut fluoresen jika dapat berfluoresensi. Beberapa
senyawa dapat ditetapkan dengan procedure fluoresensi
inheren atau dengan membuat derivat fluoresensi yang
sesuai.
Contoh uji yang disiapkan untuk spektrofotometri
fluoresensi biasanya memiliki konsentrasi 1 per 10
sampai 1 per 100 dari yang dipakai pada
spektrofotometri serapan, dengan alasan berikut. Pada
pemakaian analitik, sebaiknya fluoresensi berbanding
lurus dengan konsentrasi, namun jika konsentrasi contoh
terlalu pekat, bagian yang menonjol pada cahaya yang
datang diserap oleh zat uji dekat permukaan sel, dan
cahaya yang menuju pusat dapat tereduksi. Pada kondisi
ini, contoh dapat bertindak sebagai penyaring.
Spektrofotometri fluoresensi merupakan teknik dengan
sensitifitas tinggi, dan konsentrasi yang sering dipakai
antara 10-5 - 10-7 M. Jika perlu buat kurva kerja antara
intensitas fluoresensi dengan konsentrasi dalam hubungan
yang linier. Lakukan koreksi memakai larutan
blangko pada semua pengukuran.
Pengukuran fluoresensi sensitif terhadap debu dan
partikel padat lain pada contoh uji. Beberapa pengotor
mengurangi intensitas eksitasi dan memberi kesalahan
pembacaan yang lebih tinggi sebab terjadi refleksi ganda
pada sel contoh uji. Partikel padat dapat dihilangkan
dengan sentrifugasi, dapat juga dipakai penyaringan
tapi beberapa kertas saring mengandung pengotor
berfluoresensi.
Pengaturan suhu sering menjadi penting pada
spektrofotometri fluoresensi. Untuk beberapa senyawa,
efisiensi fluoresensi dapat berkurang 1% - 2% tiap derajat
peningkatan suhu. Pada beberapa masalah , jika presisi
maksimum diinginkan, diperlukan pengendalian suhu
pada sel contoh. Untuk analisa rutin, cukup dengan
membuat pengukuran yang cukup cepat sesampai contoh
uji tidak mengalami peningkatan suhu sebab paparan
sumber cahaya. Beberapa senyawa fluoresensi sensitif
- 1592 -
terhadap cahaya. Paparan pada fluorometer,
menyebabkan senyawa ini mengalami degradasi
menjadi produk yang lebih atau kurang befluoresensi.
Efek ini dapat dideteksi dengan mengamati respon
detektor berhubungan dengan waktu, dan dapat dikurangi
dengan atenuasi sumber cahaya dengan penyaring atau
tabir.
Perubahan pelarut dapat dengan jelas mempengaruhi
intensitas dan distribusi spektra fluoresensi. Tidak
dianjurkan untuk mengganti spesifikasi pelarut yang telah
ditetapkan pada metoda tanpa penelitian pendahuluan.
Beberapa senyawa berfluoresensi dalam pelarut organik
namun tidak berfluoresensi dalam air. Beberapa pelarut
harus dicoba untuk mengetahui senyawa berfluoresensi
atau tidak dalam pelarut ini sebelum diputuskan
untuk dipakai . Pada beberapa pelarut organik,
intensitas fluoresensi meningkat dengan berkurangnya
oksigen terlarut, yang memiliki efek pemadaman yang
kuat. Oksigen dihilangkan dengan mengalirkan gas iner
seperti nitrogen atau helium pada contoh uji.
Perbandingan intensitas fluoresensi contoh uji dengan
intensitas fluoresensi zat baku yang diperoleh pada
pengaturan alat yang sama memberi ukuran
semikuantitatif bagi kekuatan fluoresensi. Sering kali
sebagai baku pembanding dipakai larutan kuinin dalam
asam sulfat 0,1 N atau fluoresein dalam natrium
hidroksida 0,1 N dengan kadar tertentu.
HAMBURAN CAHAYA
Kekeruhan dapat diukur dengan fotometer penyaring
fotoelektrik standar atau spektrofotometer, lebih disukai
dengan iluminasi di daerah biru dari spektrum.
Pengukuran Nefelometer memerlukan alat dengan fotosel
yang ditempatkan sedemikian sampai dapat menerima
cahaya yang dihamburkan, bukan cahaya yang
ditransmisikan; geometri ini juga dipakai dalam
fluorometer, sesampai pada biasanya dengan memilih
penyaring yang sesuai, fluorometer dapat dipakai sebagai
nefelometer.
Turbidimetri perbandingan mengkombinasikan
teknologi Nefelometri 90° dan Turbidimetri; yang berisi
fotosel yang menerima dan mengukur hamburan cahaya
pada sudut 90° dari contoh dan juga menerima dan
mengukur hamburan cahaya yang diteruskan di depan
contoh; juga mengukur cahaya yang ditransmisikan
secara langsung melalui contoh.
Linieritas dicapai dengan menghitung perbandingan
pengukuran hamburan cahaya sudut 90° terhadap jumlah
pengukuran hamburan cahaya sebelumnya dan
pengukuran cahaya yang ditransmisikan.
Keuntungan memakai sistem Turbidimetri
perbandingan yaitu pengukuran cahaya yang
menyimpang dapat diabaikan.
Dalam praktek, disarankan agar dipastikan bahwa
terjadinya pengendapan partikel yang diukur dapat
diabaikan. Hal ini biasanya dilakukan dengan
memasukkan suatu koloida pelindung ke dalam medium
cairan suspensi. Hasil diintepretasikan dengan cara
membandingkan pembacaan ini dengan pembacaan
yang diperoleh pada kondisi yang tepat sama dari bahan
tersuspensi yang diketahui kadarnya.
Turbidimetri atau Nefelometri dapat dipakai untuk
mengukur endapan yang terbentuk sebab interaksi
larutan pereaksi yang sangat encer atau bahan partikulat
lainnya, seperti suspensi sel bakteri. Untuk memperoleh
hasil yang konsisten, semua variabel harus dikontrol
dengan teliti. jika kontrol semacam itu
dimungkinkan, suspensi yang sangat encer dapat diukur.
Contoh terlarut dilarutkan dalam pelarut pada berbagai
kadar yang berbeda yang diketahui dengan tepat, pilihan
kadar tergantung pada bobot molekul dari zat terlarut dan
berkisar dari 1% untuk bobot molekul = 10.000 sampai
0,01% untuk bobot molekul = 1.000.000. Setiap larutan
harus dibersihkan dengan sangat teliti sebelum
pengukuran dengan cara penyaringan berulang-ulang
melalui penyaring yang halus. Sebuah partikel debu
dalam larutan melemahkan intensitas cahaya terhambur
yang diukur. Kriteria untuk larutan yang jernih yaitu
telah dicapai minimum perbandingan intensitas hamburan
pada 45°/135°.
Kekeruhan dan indeks refraksi larutan dapat diukur.
Dari persamaan umum hamburan cahaya 90° dibuat
grafik HC/ terhadap C dan diekstrapolasikan sampai
pengenceran tak tersampai dan bobot molekul rata-rata,
M, dihitung dari titik perpotongan 1/M.
PERBANDINGAN VISUAL
Jika warna atau kekeruhan dibandingkan secara
langsung, tabung pembanding warna yang dipakai ,
diameter dalam dan semua bahan yang dipakai harus
sesuai. Untuk pembanding warna, tabung harus dapat
dilihat dari bagian atas pada latar belakang putih dengan
sumber cahaya berasal dari dasar tabung. Untuk
pembanding kekeruhan, tabung harus dapat dilihat secara
horisontal dengan latar belakang gelap dan sumber
cahaya langsung dari sisi tabung.
Pada penetapan uji batas yang memakai
pembanding warna dalam dua wadah yang serupa (misal
tabung pembanding – padanan warna), dapat dipakai
alat yang sesuai dari pada mata telanjang.
SPEKTROMETRI MASSA <1201>
Spektrometer massa dapat dipakai untuk mengukur
perbandingan massa ion terhadap muatan ion dan untuk
mempelajari proses ionisasi. Selain itu, juga
dimungkinkan untuk mempelajari reaksi ion dalam tahap
gas seperti proses dekomposisi unimolekuler dan reaksi
ion molekul.
Spektrometer massa yaitu suatu instrumen yang
menghasilkan berkasion dari suatu zat uji, memilih ion
ini menjadi spektrum sesuai dengan perbandingan
massa terhadap muatan (m/z) dan merekam kelimpahan
relatif tiap jenis ion yang ada. biasanya ion positif yang
dipelajari, sebab ion negatif yang dihasilkan dari sumber
tumbukan elektron (TE) biasanya sedikit. Dengan
- 1593 -
diperkenalkannya teknik ionisasi kimia (IK) dan
tembakan atom cepat (TAC) yang keduanya dapat
menghasilkan ion negatif yang banyak, maka perhatian
terhadap analisa ion negatif meningkat.
Secara umum, spektrometer massa terdiri dari tiga
komponen utama seperti yang ditunjukkan pada gambar
di bawah: Sumber ion untuk menghasilkan ion berbentuk
gas dari zat uji; penganalisa untuk memisahkan ion
menjadi komponen massa yang khas sesuai dengan
perbandingan massa terhadap muatan dari ion yang ada;
dan sistem detektor untuk merekam kelimpahan relatif
atau intensitas tiap jenis ion yang dipisahkan. Selain itu,
sistem pemasukan contoh diperlukan untuk memasukkan
zat uji pada sumber ion sambil tetap mempertahankan
persyaratan hampa udara yang tinggi (setara 10-6 – 10-8
torr). Seperti yang ditunjukkan pada gambar, kebanyakan
instrumen dilengkapi suatu komputer untuk memudahkan
penanganan beberapa besar data yang dihasilkan.
Penganalisa Penganalisa massa memisahkan massa
yang berbeda dalam contoh yang terionisasi, hal ini
memungkinkan penetapan massa dan akhirnya
kelimpahan atau intensitas relatif tiap jenis ion dapat
ditentukan. Empat dari beberapa metode yang umum
dipakai yaitu (1) kuadruprol (2) penganalisa
magnetik, penganalisa , (3) penganalisa waktu tempuh
dan (4) penganalisa alihragaman Fourier. Penganalisa
elektrostatik sering dipakai bersamaan dengan
penganalisa massa lainnya.
Pada metode kuadruprol, pemisahan massa dapat
terjadi dalam suatu instrumen yang terdiri dari 4 batang
koaksial, idealnya tiap batang memiliki potongan
melintang hiperbolik, namun dalam praktek batang sirkuler
yang umum dipakai . Dua batang yang berlawanan
memiliki potensial listrik yang tetap (U), dua lainnya
memiliki potensial bolak balik frekuensi radio (V, ).
Di bawah pengaruh medan listrik ini, semua ion (kecuali
satu massa tertentu) dalam berkas ion dibelokkan ke arah
sisi dan lenyap; massa terpilih (yang ditetapkan dengan
cara mengatur U,V, ) dibiarkan melewati batang-batang.
Oleh sebab semua nilai m/z lainnya ditolak kecuali satu
yang terpilih, maka kadang-kadang penganalisa disebut
penyaring massa. Teori menyatakan bahwa massa ion
yang tinggi memerlukan waktu yang lebih lama untuk
melewati penganalisa , akibatnya memiliki lebih
banyak kesempatan untuk fragmentasi maupun
bertumbukan dengan molekul gas tersisa, kepekaan
berkurang dengan meningkatnya massa: fenomena ini
disebut diskriminasi massa dan merupakan sifat dasar
dari penganalisa kuadoprol.
Dengan adanya medan magnetik yang tegak lurus
terhadap gerakan berkas ion positif, tiap ion mengalami
suatu gaya pada sudut 90° (siku) terhadap arah gerak
maupun arah medan magnet dan sebab itu berkas ion
tadi dibelikkan. Gerakan ini dinyatakan oleh
persamaan:
m yaitu massa dalam satuan massa atom; z yaitu
jumlah muatan listrik; H yaitu kekuatan medan magnet
dalam Gauss; r yaitu jari-jari lintasan ion dalam cm; dan
V yaitu tegangan akselerasi. Spektrum massa dihasilkan
dengan merubah kekuatan medan magnet dan mendeteksi
ion yang melewati celah keluar pada saat difokuskan.
Dalam penganalisa waktu tempuh, pemisahan ion
dengan massa yang berbeda berdasarkan pada pemberian
energi yang sama kepada semua ion. Oleh sebab itu ion
dengan massa yang berbeda, memiliki kecepatan yang
berbeda. Jika ion melewati jarak tertentu, waktu tempuh
jarak ini akan bervariasi sesuai dengan massanya.
Massa yang lebih ringan bergerak lebih cepat dan
mencapai detektor dalam jangka waktu yang lebih
pendek. Waktu tempuh diberikan oleh rumus :
z
mkft =)(
t (f) yaitu waktu tempuh dalam detik; m dan z yaitu
sama dengan yang telah diuraikan sebelumnya. Oleh
sebab itu, waktu tempuh berbagai ion yaitu sebanding
dengan akar kuadrat dari perbandingan massa terhadap
muatan ion.
Spektrometer massa alihragaman Fourier (SMAF)
yaitu teknik yang didasarkan pada gerakan siklotron ion
dalam medan magnet yang beragam. Dalam medan
magnet dengan kerapatan B, ion dipaksa bergerak dalam
orbit yang sirkuler (siklotron). Frekuensi sudut, , dari
gerakan siklotron diberikan oleh persamaan :
m
Bz ×
=
Dalam spektrometer massa resonansi siklotron, orbit
siklotron dapat diperluas dengan menempatkan ion pada
medan listrik bolak-balik. Jika frekuensi dari pembangkit
sinyal sesuai dengan frekuensi siklotron, ion dipercepat
secara teratur mencapai radius yang makin lama makin
besar sampai terjadi suatu gerakan koheren (dari beberapa
ion) sesuai dengan beberapa energi kinetik yang
bermakna. sesudah eksitasi dihentikan, ion siklotronik
menaikkan arus bolak-balik tertentu pada elektrode-
elektrode yang lalu diperkuat. analisa frekuensi
terhadap sinyal penerima menghasilkan massa dari ion
yang terlibat dengan ketepatan tinggi. Oleh sebab itu,
alihragaman Fourier dari sinyal yang waktunya hanya
Penganalisa
Detektor
Komputer
Sistem Pemasukan
Contoh
Sumber Ion
- 1594 -
sebentar menghasilkan spektrum frekuensi untuk
komputasi spektrum massa.
Teknik ionisasi Ion positif dapat dihasilkan dengan
melewatkan berkas elektron, melalui gas pada tekanan
lebih kurang 10-4 - 10-6 mmHg. Dapat juga dipakai
tekanan yang berbeda dengan tekanan diatas, namun
rentang tekanan ini yaitu yang paling umum.
Energi berkas elektron biasanya terkendali. Jika energi
berkas elektron lebih besar dari potensial ionisasi gas,
elektron dapat menyebabkan ionisasi dan/atau
fragmentasi molekul gas yang ditunjukkan sebagai
berikut :
e- + M M+· + 2e-
Sumber jenis ini disebut sumber tumbukan elektron
(TE). Elektron biasanya diemisikan dari filamen
tungsten atau rhenium yang dipanaskan.
Ion yang dibentuk dalam bejana ionisasi dipercepat
melalui celah keluar dari sumber menuju daerah
penganalisa oleh suatu medan penolakan/penarikan yang
sebagian ditetapkan oleh penetrasi medan melalui celah
keluar sumber dan sebagian lagi oleh potensial kecil yang
diberikan pada lempeng penolak ion dalam bejana
ionisasi. Ion selanjutnya dipercepat oleh medan yang jauh
lebih besar antara bejana ionisasi dan celah keluar
sumber, celah terakhir berada pada potensial dasar.
Konversi suatu spektrometer massa menjadi modus ion
negatif yaitu mudah, dan alat modern dirancang untuk
melaksanakan procedure itu secara otomatik pada
pemilihan parameter tunggal. Secara teoritis, semua yang
diperlukan yaitu membalikkan arah semua tegangan dan
medan percobaan. Ion negatif juga dibentuk dalam
berbagai proses ionisasi di atas, sedangkan pemasukan
contoh dengan penampang melintang penangkapan
elektron yang tinggi menghasilkan pembentukan ion
negatif yang berlimpah. sebab itu, seringkali dibuat
turunan multi-halida dari senyawa uji.
Spektrum massa ion negatif telah berhasil dipakai
dalam analisa pestisida sebab strukturnya sesuai dengan
teknik ini.
Dalam sumber ionisasi medan (IM) ion terbentuk
dalam medan elektrostastik kuat yang terbentuk pada
ujung kawat elektrode yang dialiri tegangan tinggi. Ion
yang terbentuk dari molekul yang berada pada ujung
kawat hampir semua yaitu ion induk. Sumber tidak
dipakai secara luas namun sangat bermanfaat untuk
mempelajari molekul yang sangat tidak stabil atau
campuran yang sangat kompleks dan dalam mempelajari
reaksi permukaan.
Desorpsi medan (DM) dapat dianggap sebagai
perluasan ionisasi medan, perbedaan utamanya yaitu
bahwa contoh dilapiskan pada ujung pengemisi ion
medan dan ionisasi terjadi dari tahap padat. Teknik ini
memerlukan pengalaman untuk memperoleh hasil yang
dapat dipercaya. Spektrum massa yang terutama terdiri
dari ion molekular dapat direkam dari senyawa yang
sangat tidak mudah menguap dan tidak stabil terhadap
panas.
Ionisasi kimia (IK) yaitu teknik ionisasi sekunder
yang populer, dan kebanyakan instrumen baru dilengkapi
dengan fasilitas ini.
Dalam ionisasi kimia, gas pereaksi pada tekanan lebih
kurang 0,1 sampai 10 torr dimasukkan pada sumber dan
teronisasi. Pada tekanan ini, terjadi reaksi molekul-ion
dan terjadi reaksi lebih lanjut ion gas pereaksi primer.
Gas pereaksi yang paling umum dipakai yaitu
metana, isobutana, dan amonia. Reaksi yang khas untuk
metana ditunjukkan oleh persamaan berikut ini :
CH4 + e CH4
+ • + CH3
+ • + CH2
+ •
CH4
+ • + CH4 CH5
+ + CH3•
CH3
+ + CH4 C2H5
+ + H2
CH5
+ merupakan asam kuat Bronsted dan dapat
memindahkan proton kepada kebanyakan senyawa
organik sebagai berikut :
CH5
+ + M MH+ + CH4
Dengan metana, ion molekul terprotonasi (MH+) yang
terbentuk mula-mula dapat memiliki energi yang
cukup untuk terionisasi lebih lanjut.
Dengan metode tembakan atom cepat (TAC)
memakai berkas atom netral yang cepat untuk
menembaki contoh, sebab itu persyaratan pertama teknik
ini yaitu berkas atom yang bergerak cepat, diarahkan
dengan tepat pada contoh sasaran, yang dilarutkan dalam
matriks cair yang tidak menguap. Hal ini relatif mudah
dan metode untuk menghasilkan berkas atom ini
telah dikembangkan dengan baik. Penembak ion
dipakai untuk menghasilkan berkas ion xenon yang
mengalami pertukaran muatan dalam sel penumbuk
dengan gas xenon cepat yang diperlukan. Prosesnya
disimpulkan pada persamaan berikut:
Xe Xe+ + e
Xe+ + Xe Xe + Xe+
Tanda panah di bawah menampilkan bahwa partikel
bergerak cepat.
sebab teknik tembakan atom cepat (TAC) yaitu
teknik analisa permukaan, penyiapan contoh dalam
rangka mengoptimalkan kondisi permukaan yaitu sangat
penting. Jika contoh dilapiskan pada ‘probe’ melalui
penguapan larutan, berkas ion contoh yang dihasilkan
sering tidak tetap. Sering dihasilkan ion antara.
Kecenderungan
.jpg)
